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主题：【原创】极限体验之用月旭柱做化学反应的液相条件摸索

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chqiu111111

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发表于：2010/04/18 23:26:55 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

该帖子已被samanthalas设置为精华；

本人正在做一个合成，酰化反应，用高效液相色谱法来判定反应的终点。由于本人底子差，不懂如何做，我查了资料，但是对具体的关键步骤基本都没有，现将我对于液相条件的摸索，希望大家指点指点。由于反应底物和产物老师需要保密，所以我就暂时不告诉大家。

柱子：月旭柱，XB-C18，5μm，4.6*250mm。

1、这是底物峰。液相条件：月旭C18柱，柱温25，流动相，乙腈：磷酸盐ph8，25mmol=10：90.流速1ml/min。检测波长220nm。

2、下面这个是底物峰，产物峰。液相条件：月旭C18柱，柱温25，流动相，乙腈：磷酸盐ph8，25mmol=10：90.流速1ml/min。检测波长220nm。因为我之前对于这个方面做得很少，所以，我也不懂为什么会是这样，分不开，按照道理，应该只有3个峰出现，底物、产物、副产物

由于这个峰型和峰面积太难看了，我想是不是因为我的检测波长选择不对。所以第二天我就用DAD检测器来看应该选择多少波长合适。根据后面的实验结果来看，之所以分不开，不是因为流动相选择有错，而是因为产物、副产物、底物的浓度太高了。液相的响应值太高了。

3、这是底物峰。流动相是：月旭C18柱,室温,21度.流动相:乙腈:25mmol磷酸缓冲盐PH3。5=10:90,DAD检测,流速,1 ml/min.

根据3D图谱，这个底物峰在200-300nm处有吸收。

4、这是反应后的峰。月旭C18柱,室温,21度.流动相:乙腈:25mmol磷酸缓冲盐PH3。5=10:90,DAD检测,流速,1 ml/min.

根据上面的图谱可以得知，底物峰和产物峰的吸收波长都在200-250nm处有吸收波长。选择最好的是在220nm处比较好。所以我们往后就选用220nm为吸收波长。选择合适的波长对于液相是很重要的，如果选择的波长刚好此物质没有吸收，就算浓度很大，在图谱上也反映不出来。波长选择出来了，就开始选择流动相。

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2010/4/18 23:59:30 沙发管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

5、流动相：25mmol ph8的磷酸盐缓冲液：乙腈=95：5 99bar 底物峰

6、流动相：25mmol ph8的磷酸盐缓冲液：乙腈=95：5 99bar 产物峰

7、流动相：25mmol ph5的乙酸钠盐缓冲液：乙腈=95：5 104bar 底物峰

8、流动相：25mmol ph5的乙酸钠缓冲液：乙腈=95：5 104bar 产物峰

9、流动相：25mmol ph5的乙酸钠缓冲液：甲醇=80：20 139bar 底物峰

10、流动相：25mmol ph5的乙酸钠缓冲液：甲醇=80：20 139bar 产物峰

11、流动相：25mmol ph5的乙酸钠缓冲液：甲醇=90：10 116bar 底物峰

12、流动相：25mmol ph5的乙酸钠缓冲液：甲醇=90：10 116bar 产物峰

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2010/4/19 0:03:45 板凳管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

13、流动相：ph3.5的磷酸盐缓冲液：乙腈 =95：5 99bar 底物峰

14、流动相：25mmol ph3.5的磷酸盐缓冲液：乙腈 =95：5 99bar 产物峰

15、流动相：10mmol ph8的乙酸铵缓冲液：乙腈 =95：5 105bar 底物峰

16、流动相：10mmol ph8的乙酸铵缓冲液：乙腈 =95：5 105bar 产物峰

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2010/4/19 0:04:04 马扎管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

总结：

1、25mmol ph8的磷酸盐缓冲液：乙腈=95：5 时，底物峰的出峰时间、产物

副产物出峰时间分别为5.78min、3.9min、2.6min (根据5号和6号)。

2、流动相：25mmol ph5的乙酸钠盐缓冲液：乙腈=95：5 时，底物峰的出峰时间、产物

副产物出峰时间分别为4.75min、3.75min、2.7min (根据7号和8号)。

3、流动相：25mmol ph5的乙酸钠缓冲液：甲醇=80：20 时，底物峰的出峰时间、产物

副产物出峰时间分别为4.16min、3.35min、2.7min (根据9号和10号)。且有倒峰出现，且峰比较杂。

4、流动相：25mmol ph5的乙酸钠缓冲液：甲醇=90：10 底物峰的出峰时间、产物

副产物出峰时间分别为6.2min、4.1min、2.7min (根据11号和12号)。

5、流动相：ph3.5的磷酸盐缓冲液：乙腈 =95：5 只有底物峰出现，产物峰和副产物都没有出峰。(根据13号和14号)。后面用10mmol ph8的乙酸铵缓冲液：乙腈 =95：5跑基线时，有很多峰出现。说明这种流动相不适合。

6流动相：10mmol ph8的乙酸铵缓冲液：乙腈 =95：5底物峰的出峰时间、产物

副产物出峰时间分别为5.2min、3.48min、2.5min (根据15号和16号)。

根据以上图谱看，还是用ph8的缓冲液：乙腈作为流动相最合适。

对于这个液相条件的摸索就是大概要按照以下的方法：

1、先选择合适的波长。

2、再选择合适的流动相，包括流动相的柱温、ph值，这里我只试了ph值，就已经很好了，所以我不用调柱温了。

3、使用的时候液体的浓度不要太高，如果太高的，即使峰已经分开，但是峰的响应值太大，看起来也是没有分开的。

这就是我使用月旭柱做化学合成的一点心得，希望各位高手指点，也希望能给后面做实验的人一点思路。

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2010/4/19 0:05:05 地毯管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

我真的希望高手来指点一下，希望能够分享一下你们的经验。我们新人，真的很多都不懂该怎么做！

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毛毛儿

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2010/4/19 17:08:41 地板管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

我觉得大家在做分析的时候，动用一切可以动用的资源，往往可以事半功倍的！

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huaibeijiayuan

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2010/4/20 9:02:08 6楼管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

原文由 chqiu111111(chqiu111111) 发表:
我真的希望高手来指点一下，希望能够分享一下你们的经验。我们新人，真的很多都不懂该怎么做！

如果是规定的方法，不可以随意改动，不然要做对照试验的

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小卢

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2010/4/20 12:06:33 7楼管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

分析的太好了，看来DAD的用处很大啊！
方法分析借鉴的话，很好的模板!

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qingqingcao

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2010/4/20 12:07:46 8楼管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

分离度不错。但是使用pH=8的缓冲液似乎太高了，伤色谱柱。
同时柱温对分离没有什么帮助，只是温度升高，柱压会降低些。
流速一般在0.8-1.4之间。
检测波长用DAD 确实很方便。我02年用的还是比较老土的DAD。没有3D的。
确实使用杂质吸收少的主峰吸收的可以排除许多干扰，这是UV-VIS 的优势之一。我也用过该方法。

该帖子作者被版主 samanthalas加 5积分， 2经验，加分理由：欢迎您分享专业的想法

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2010/4/20 17:29:58 9楼管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

原文由 小卢(luxw) 发表:
分析的太好了，看来DAD的用处很大啊！
方法分析借鉴的话，很好的模板!

就是因为我是新手，很多东西都不懂，自己慢慢摸索的。呵呵，我也很希望能够站在前人的肩膀上，但是查了很多资料，都没有详细的步骤。我只希望能够对以后做的人一个思路而已。对于高手来说，的确很平常，但是对于初学者来说，真的得摸索很长一段时间啊！呵呵

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2010/4/20 17:36:39 10楼管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

原文由 qingqingcao(qingqingcao) 发表:
分离度不错。但是使用pH=8的缓冲液似乎太高了，伤色谱柱。
同时柱温对分离没有什么帮助，只是温度升高，柱压会降低些。
流速一般在0.8-1.4之间。
检测波长用DAD 确实很方便。我02年用的还是比较老土的DAD。没有3D的。
确实使用杂质吸收少的主峰吸收的可以排除许多干扰，这是UV-VIS 的优势之一。我也用过该方法。

呵呵，我做的是化学药品，我之前做过另外一个反应，柱温的25度与柱温20度，对我的影响就很大，柱温20度的时候就可以分开，如果25度就不可以分开。其实我也不想用缓冲液来做，但是没有办法啊，用水直接做的话，会有倒峰出现。我做的缓冲液浓度也不高，10mmol而已。其实我觉得我这根月旭柱挺好的，我用了半年，是普通的柱子，每次用完洗4个小时，我差不多进样至少有几百针了，呵呵！对柱子迄今为止还没有什么太大的影响，呵呵！

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