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主题：【第六届原创】新型键合材料（amide）在分离小核酸中的应用

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gaoshan_lanjing
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发表于：2012/09/28 11:47:15 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
维权声明：本文为gaoshan_lanjing原创作品，本作者与仪器信息网是该作品合法使用者，该作品暂不对外授权转载。其他任何网站、组织、单位或个人等将该作品在本站以外的任何媒体任何形式出现均属侵权违法行为，我们将追究法律责任。
键合硅胶基质的正相色谱在分离小核酸中的应用

小核酸异构体的纯化通常是用正相硅胶或者反相C18或C8。这两种模式都有它的缺陷：反相的分离度比较好，但相比正相，它的上样量较小，且后处理中，由于流动相中大量水的存在，导致旋蒸会比较麻烦，甚至会出现温度过高或者处理时间过长而使样品变质的情况；纯硅胶的正相色谱，尽管比较便宜，但由于小核酸的极性较大，导致固定相对样品的西服严重，回收率比较低，而且硅胶不能多次利用，所以，换来换去的，人力成本也是很贵的。用酰胺键合硅胶作为正相色谱固定相，综合了硅胶和反相C18/C8的优势：具有特殊的立体选择性，对小核酸异构体的分离较好，极性较硅胶弱，解决了由于吸附造成的低回收率问题，而且它可以反复使用数百次，所以用这种填料分离纯化小核酸，优势明显。







下面是小核酸在结构修饰过程中，产生的几种异构体：

                2’-BaG                                    3’-BaG                                       Dimer-BaG 

2’-BaG 是目标物，占到30-40%，几种异构体的性质差别不大，分离比较有难度。用硅胶柱，过柱需要10个小时，回收率不到40%，装柱和卸柱一次需要7个小时，所以使用成本还是很高的。反相色谱，后期除水的旋蒸温度要超过50℃，样品很容易在这个温度变质。用键合硅胶（amide），上样量、回收率、纯度、样品分离时间和后处理都表现不俗。

下图是反相色谱的分析图谱：

Figure 1  the sample analysis chromatogram used column Venusil® XBP C18（L）(4.6×250 mm，5 μm，150Å)；Elution condition was the mixture of 0.03%TFA and CAN(25:75)；wavelength was 254 nm and flow rate was 1ml/min with 35℃ column temperature

制备时就用到了我们的amide。

Venusil®  Hilic Flash柱（120g，20-45μm， 100Å)， 流动相用正己烷混合乙酸乙酯（2:8），分离可以在两个小时内解决战斗，上样量为2.5g, 三种异构体得到了很好的分离。


Figure 2 The sample preparation chromatogram used column Venusil® Hilic, and used normal phase chromatographic mode, 3 isomers separated very well.



纯度检测:

30℃下，馏分用旋蒸蒸干，得到粉末0.61g，回收率为74%，纯度超过98%。


Figure 3  2’-BaG detection by reverse phase analysis chromatogram

Conclusions：

像2’-BaG这样的小核酸可以用酰胺键和硅胶很好的实现分离，上样量、回收率、分离周期、后处理等方面，能够取得比正相硅胶或反相C18/C8等更好的分离效果，我们可以尝试分离更多的小核酸。
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有水有渝
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2012/9/28 14:01:57 沙发 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
酰胺键合硅胶与普通的氨基柱与氰基柱有什么优势没有？除了性能，价格方法有优势吗？
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小不董
doxw0323
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2012/10/5 7:46:36 板凳 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
色谱中的峰分别对应什么物质没标示出来,需猜测哟,纯度检测用的色谱柱和分析的柱子也是一个吗?看起来不像
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jianzhu_zhang
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2012/10/18 10:00:30 马扎 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
有个疑惑：
你的反相分析上明显的目标物有3个，为什么使用HILIC后就出现4个峰呢？而且未标明目标物是哪个。
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gaoshan_lanjing
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2012/11/4 13:46:08 地毯 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
回复有水又渝：
    酰胺键合硅胶可替代大部分的氨基柱的分析或分离的应用，但相对氨基柱更加稳定，流动相中允许水的比例大幅度提高，甚至可以到纯水做流动性；寿命根据使用，可以达到数百次；腈基柱的使用范围比较窄，不太常用，所以不太好说他们的对比结果。价格的话，需要咨询厂家了，应该会贵一点儿。
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gaoshan_lanjing
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2012/11/4 13:54:50 地板 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
回复小不董：
    抱歉，帖子写得确实很粗，制备中的34min、59min的两个峰，应该对应的是分析中的10min、13min两个峰；且目标峰是34min的那个。不是靠猜，其实分离中得到的是5个峰。3min、5min、15min、34min和59min。分别作了液相的检测；分析图中其实还有一个小峰在24min的，其实也是一个干扰物，就是dimer的那个峰。在正相中出在5min的位置，和另一个杂质分析图上3min的峰出在一起了。
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gaoshan_lanjing
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2012/11/4 14:00:33 6楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
回复jianzhu_zhang:
    其实分析比较明显的峰是5个，分别是：3min、4min、10min、13min和24min；制备中比较明显的峰是4个；原因是分析中的3min和24min的峰在制备中，叠加在一起了，出在5min。
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houjjun
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2012/11/4 14:51:14 7楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
一般的客户都关心性能、价格和寿命
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gaoshan_lanjing
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2012/11/6 12:25:06 8楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
回七楼：
    关于性能，我们做过一些相关的案例，还是不错的，可以说70%的氨基柱案例都可以用这个柱子来替代；60%的硅胶柱案例，用hilic分离可以完全取代；上样量和回收率都不错；也没有像硅胶那样大的死吸附，所以寿命就很好。这个案例只做了20多针，项目就结束了。别的项目，我们专门考察过的，100多针没问题。至于价格，会贵点，但是如果稳定性好，综合价格就会低不少；就看比的标准是什么了。
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gaoshan_lanjing
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2012/11/21 21:06:43 9楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 houjjun(houjjun) 发表:
一般的客户都关心性能、价格和寿命


嗯。性价比很重要，耐用，还得便宜，呵呵。
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houjjun
houjjun
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2012/11/21 21:09:16 10楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原文由 gaoshan_lanjing(gaoshan_lanjing) 发表:
原文由 houjjun(houjjun) 发表:
一般的客户都关心性能、价格和寿命


嗯。性价比很重要，耐用，还得便宜，呵呵。
还得好用
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