主题：【第六届原创】HPLC-ELSD法测定清开灵含片中猪去氧胆酸和胆酸的含量

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tangtang

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发表于：2012/12/31 12:51:27 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

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这是一篇很久以前写的，压在箱底都长霉了，拿出来晒晒，略作修改，支持分坛团队和化学药分析版。

我们对清开灵含片中猪去氧胆酸和胆酸的含量测定进行了研究。

1.供试品来源

胆酸对照品（中国药品生物制品检定所）；

猪去氧胆酸对照品（Sigma公司）；

清开灵含片阴性样品（未加猪去氧胆酸和胆酸）和清开灵含片样品。

2.含量测定

2.1仪器与试药

岛津LC-10A高效液相色谱仪，Alltech ELSD 2000 蒸发光散射检测器，甲醇为色谱纯，水为超纯水。

2.2测定法

【含量测定】照高效液相色谱法（中国药典二部附录V D）测定

色谱条件与系统适用性试验以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以甲醇-水-**为流动相，流速1.0ml/min，柱温35℃；用蒸发光散射检测器检测，空气流速2.0L/min，漂移管温度110℃，不分流模式；理论板数按猪去氧胆酸峰计算应不低于3000，猪去氧胆酸峰与胆酸峰之间的分离度应符合要求。

对照品溶液的制备取猪去氧胆酸对照品11.5mg和胆酸对照品10mg，精密称定，置同一50ml量瓶中，加乙醇适量，超声处理15分钟使溶解，放冷至室温，加乙醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液，同法制备两份。

标准曲线的制备分别精密量取第一份对照品溶液6μl、10μl、14μl，第二份对照品溶液8μl、12μl，注入液相色谱仪，依法测定猪去氧胆酸和胆酸的峰面积，分别计算各自的回归方程，相关系数均应不得小于0.999。

供试品溶液的制备取本品10片，精密称定，研细，取相当于胆酸10mg的粉末，精密称定，置50ml量瓶中，加乙醇适量，超声处理15分钟，放冷至室温，加乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

测定法精密量取供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，依法测定猪去氧胆酸和胆酸的峰面积，代入各自的回归方程，计算，即得。

2.3检测方法的确定

清开灵含片成分复杂，要对其中各组分分别定量测定，首选高效液相色谱法。

2.4检测器的确定

经文献检索，比较成功的例子均用高效液相－蒸发光散射检测法。

2.5蒸发光散射检测器参数的确定

考察了气流、漂移管温度的不同变化，对比了分流和不分流模式，确定最佳参数为空气流速2.0L/min，漂移管温度110℃，不分流模式。

2.6溶剂的确定

考虑猪去氧胆酸和胆酸在乙醇中溶解度较好，乙醇比较安全且废弃液易处理，定为使用乙醇作溶剂。

2.7色谱柱的确定

我们配制了猪去氧胆酸和胆酸的混合对照品溶液，照上述色谱条件，考察了常见的几种色谱柱，列表如下：

填料	规格	猪去氧胆酸峰理论板数	胆酸峰理论板数	分离度
A	250×4.6mm， 5μm	8300	9091	2.71
B	150mm	8792	9545	2.07
C	250×4.6mm， 5μm	4633	峰未分开	/
D	250×4.6mm， 5μm	2130	1124	0.41

可以看出，A色谱柱效果最好。

2.8.线性关系

取猪去氧胆酸对照品11.53mg（折纯后为11.51mg），胆酸对照品10.21mg，置50ml量瓶中，加乙醇使溶解并稀释至刻度，摇匀。照上述色谱条件，分别精密量取5、10、15、20、25μl，注入液相色谱仪，测定。

对照品溶液浓度：猪去氧胆酸11.51mg/50ml＝230.2μg/ml，胆酸10.21mg/50ml＝204.2μg/ml。

猪去氧胆酸在进样质量1.151～5.755μg的范围内，回归方程为

y＝792645x-420384，r²＝0.9996

数据：

猪去氧胆酸浓度（μg/ml）	进样量（μl）	进样质量μg	峰面积
230.2	5	1.151	518029
230.2	10	2.302	1357061
230.2	15	3.453	2337931
230.2	20	4.604	3223683
230.2	25	5.755	4146388

标准曲线：

在进样质量1.021～5.105μg的范围内，回归方程为

y＝722271x-367652，r²＝0.9994

数据：

胆酸浓度（μg/ml）	进样量（μl）	进样质量μg	峰面积
204.2	5	1.021	397798
204.2	10	2.042	1061095
204.2	15	3.063	1850375
204.2	20	4.084	2597030
204.2	25	5.105	3317025

标准曲线：

通常，蒸发光散射检测器的响应峰面积的对数值和样品质量的对数值呈线性关系。但就本实验而言，猪去氧胆酸和胆酸的峰面积与样品质量呈线性关系。

计算校正因子：

猪去氧胆酸浓度（μg/ml）	进样量（μl）	进样质量μg	峰面积	校正因子	RSD
230.2	5	1.151	518029	2.2219E-06	21.0%
230.2	10	2.302	1357061	1.6963E-06
230.2	15	3.453	2337931	1.4769E-06
230.2	20	4.604	3223683	1.4282E-06
230.2	25	5.755	4146388	1.3880E-06

胆酸浓度（μg/ml）	进样量（μl）	进样质量μg	峰面积	校正因子	RSD
204.2	5	1.021	397798	2.5666E-06	23.1%
204.2	10	2.042	1061095	1.9244E-06
204.2	15	3.063	1850375	1.6553E-06
204.2	20	4.084	2597030	1.5726E-06
204.2	25	5.105	3317025	1.5390E-06

可以看出，猪去氧胆酸不同浓度校正因子RSD为21.0％，胆酸不同浓度校正因子RSD为23.1％，表明不宜采用校正因子的方法计算含量，应采用标准曲线法。

2.9专属性

2.9.1猪去氧胆酸

取猪去氧胆酸对照品4.47mg置25ml量瓶中，加乙醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，进样，保留时间约7.9分钟：

2.9.2胆酸

取胆酸对照品4.50mg置25ml量瓶中，加乙醇使溶解并稀释至刻度，摇匀，进样，保留时间约8.8分钟：：

2.9.3清开灵含片样品

取清开灵含片样品0.2667g置25ml量瓶中，加乙醇超声15分钟，放冷，加乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，进样，色谱图如下，在猪去氧胆酸和胆酸相应的色谱图位置上呈现保留时间一致的色谱峰：

注：其中猪去氧胆酸峰前有一小峰，为清开灵含片样品所用猪去氧胆酸原料不纯所带入。

2.9.4清开灵含片阴性样品

取清开灵含片阴性样品0.2668g置25ml量瓶中，加乙醇超声15分钟，放冷，加乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，进样，色谱图如下，在猪去氧胆酸和胆酸对应的色谱图位置上没有呈现色谱峰：

专属性实验结果表明本实验确定的方法测定清开灵含片待测成分猪去氧胆酸和胆酸专属性良好，其它成分无干扰。

2.10精密度

2.10.1进样重复性

取上述对照品溶液，连续进样6次，结果

猪去氧胆酸溶液	进样15μl猪去氧胆酸峰面积	RSD
n=6	2298133	1.34%
	2254824
	2219720
	2298702
	2266382
	2251042

胆酸溶液	进样15μl胆酸峰面积	RSD
n=6	1810377	1.26%
	1786065
	1748519
	1802386
	1769824
	1779266

2.10.2样品测定

取清开灵含片样品10片，精密称定，研细，精密称取适量，置50ml量瓶中，超声15分钟，放冷，加乙醇稀释至刻度，摇匀，滤过，进样，结果

称样量（g）	猪去氧胆酸峰面积	含量	RSD
0.5173	978978	1.138%	1.34%
0.5235	980141	1.125%
0.5251	966618	1.111%
0.5164	932565	1.102%
0.5218	973853	1.124%
0.5182	985314	1.141%

称样量（g）	胆酸峰面积	含量	RSD
0.5173	575982	0.842%	1.67%
0.5235	575042	0.831%
0.5251	560174	0.815%
0.5164	554196	0.824%
0.5218	566375	0.826%
0.5182	591455	0.854%

结果表明精密度良好。

2.11进样量的确定

观察基线噪声，约±0.5mv～±1mv左右，为保证测定精度，待测成分的色谱峰应在100mv左右，误差才较小，但峰面积过大也容易发生峰变形。经测定，猪去氧胆酸在称样量为11.5mg，稀释至50ml，进样10μl的条件下，产生的色谱峰高度约为100mv，误差约为0.5/100～1/100=0.5%～1.0%。胆酸在称样量10mg，稀释至50ml，进样10μl的条件下，产生的色谱峰高度约为70～80mv，误差约为0.5/70～1/70=0.7%～1.4%，基本上在高效液相测定允许的误差范围内。因此确定样品进样量为10μl，对照品进样量以10μl为中心上下扩展，进样6μl、8μl、10μl、12μl、14μl。

2.12回收率

猪去氧胆酸回收率

阴性样品g	对照品mg	进样量 μl	峰面积1	峰面积2	回收率1	回收率2	平均回收率	平均	RSD	浓度
0.5215	12.76	10	1417517	1409244	101.04%	100.58%	100.8%	99.2%	1.52%	100％
0.5220	11.84	10	1243776	1253365	98.63%	99.20%	98.9%
0.5223	11.65	10	1203440	1203759	97.82%	97.84%	97.8%
0.5245	9.11	10	882197	895580	100.44%	101.47%	101.0%	99.3%	1.60%	80％
0.5285	9.40	10	887190	889898	97.72%	97.92%	97.8%
0.5178	9.58	10	939255	920384	99.68%	98.30%	99.0%
0.5267	14.06	10	1607934	1614574	101.16%	101.49%	101.3%	101.4%	0.47%	120％
0.5156	13.64	10	1550221	1538312	101.32%	100.71%	101.0%
0.5224	14.32	10	1654665	1668752	101.60%	102.29%	101.9%

胆酸回收率

阴性样品g	对照品mg	进样量 μl	峰面积1	峰面积2	回收率1	回收率2	平均回收率	平均	RSD	浓度
0.5215	10.17	10	921604	918519	98.27%	98.03%	98.1%	98.3%	0.16%	100％
0.5220	10.54	10	963484	972986	98.01%	98.74%	98.4%
0.5223	11.55	10	1086943	1098635	98.03%	98.85%	98.4%
0.5245	8.17	10	680250	674928	98.59%	98.07%	98.3%	98.4%	0.64%	80％
0.5285	8.77	10	743833	745268	97.67%	97.80%	97.7%
0.5178	8.83	10	764684	766812	98.90%	99.10%	99.0%
0.5267	11.91	10	1175793	1142874	101.06%	98.84%	100.0%	100.5%	0.60%	120％
0.5156	11.95	10	1174601	1171287	100.65%	100.42%	100.5%
0.5224	12.41	10	1221007	1259004	99.92%	102.38%	101.2%