乳制品中三聚氰胺的高效液相色谱检测法
三聚氰胺(Melamine)是一种重要的三嗪类含氮杂环有机化工原料,主要用于生产三聚氰胺-甲醛树脂,广泛用于木材加工、塑料、涂料、造纸、纺织、皮革等行业,为白色晶体。三鹿奶粉事件引发了对三聚氰胺检测的广泛关注。本方法适用于原料乳,也适用于不含添加物的液态乳制品。本方法定量检测范围为0.03mg/kg~100.0mg/kg。
本文参考了国标等标准并进行配制条件优化,建立了乳制品中三聚氰胺的高效液相色谱检测法,前处理简单,检测限、精密度、重现性以及回收率均符合国家标准。
实验部分:
原理:
乳制品试样经溶解、超声提取、沉淀蛋白、过滤萃取得到测试液,经高效液相色谱测定,根据紫外吸收光谱保留时间定性,峰面积进行定量计算。
仪器及设备:
1. 等度高效液相色谱系统(紫外检测器、柱温箱)
2. 分析天平
3. 离心机:转速不低于4000r/min,配50mL离心管
4. 超声清洗器
5. 涡漩混合器
6. 研钵(样品为奶酪,奶油和巧克力等时选用)
7. 固相萃取装置
8. 氮气吹干仪
9. 具塞塑料离心管
10. 真空泵和溶剂过滤器(过滤流动相用)
11. PH计:测量精度±0.2
试剂及材料:
1. 甲醇:色谱纯。
2. 乙腈:色谱纯。
3. 氨水:含量为25%~28%。
4. 三氯乙酸。
5. 柠檬酸。
6. 辛烷磺酸钠:色谱纯。
7. 三聚氰胺标准品:纯度大于99.0%
8. 阳离子交换固相萃取柱:混合型阳离子交换固相萃取柱,基质为苯磺酸化的聚苯乙烯-二乙烯基苯高聚物,60 mg,3 mL。
9. 定性滤纸
10. 海砂:化学纯,粒度0.65 mm~0.85 mm,二氧化硅(SiO2)含量为99%(样品为奶酪,奶油和巧克力等时选用)。
11. 微孔滤膜:0.2μm,有机相
12. 氮气:纯度大于等于99.999%。
13. 一次性注射器标准品溶液配制:精密称取三聚氰胺标准品,溶于50%的甲醇水溶液,配制称50.0mg/ml的标准储备液,于4℃避光保存。根据实验需要,用流动相逐级稀释成适当浓度的标准工作液。
样品前处理:
称取2g酸奶样品与50ml具塞离心管中,加入乙腈:水=50:50混合溶液15ml,充分混匀后超声提取15min。取提取液250ul,加入0.1mol/l盐酸750ul,混匀,以12000r/min离心5min,取上清液,滤纸虑过,固相萃取,氮气吹干,定容,0.22um滤膜过滤,作为HPLC测定溶液。
流动相:乙腈/缓冲盐=15/85(缓冲盐:10mM辛烷磺酸钠水溶液,含0.1%磷酸)流速:1.0ml/min
波长:240nm
温度:40℃进样量:20μl
色谱图:
图1 三聚氰胺标准品
实验结果:精密度实验取浓度为0.5μg/ml三聚氰胺标准工作液,按上述色谱条件,连续进样5次,以各成分峰面积计算RSD(%),所得结果如表1所示:保留时间相对标准偏差(RSD)为0.23%,峰面积RSD为0.26%。
表1 精密度实验
序号 | 保留时间(min) | 峰高 | 峰面积 |
1 | 11.93 | 289 | 4236.8 |
2 | 11.94 | 290 | 4264.2 |
3 | 11.96 | 287 | 4246.0 |
4 | 11.92 | 287 | 4242.8 |
5 | 11.95 | 288 | 4238.6 |
RSD(%) | 0.13 | 0.45 | 0.26 |
标准曲线:
配置浓度分别为0.2、0.5、1.0、2.0、6.0、15.0μg/mL的三聚氰胺标准工作液。将以上6种标准工作液在上述色谱条件下按浓度由低至高进样。用最小二乘法以对照品浓度(横坐标X轴,μg/ ml)对峰面积(纵坐标Y轴)进行线性回归,求算标准曲线。加样回收率和重现性实验
取已知三聚氰胺含量的酸奶样品,加入一定量的标准储备液,按“样品前处理” 操作,平行制备3份,得到样品溶液后按上述色谱条件进样分析,得到加样回收率及重现性结果,见表2。
Spiked(mg/kg) | Recovery(%) | RSD(%) |
35.0 | 87.2 | 1.37 |
图2 空白酸奶样品
图3 加酸奶样品
检测限及定量限:
依据噪声值,按3倍信噪比,计算其理论检出限,为0.021 mg/kg;按10倍信噪比,计算其定量限,为0.067 mg/kg。
结论:
本方法优化了高效液相色谱法检测乳制品中三聚氰胺测定方法,该方法简化了前处理步骤,易于操作,线性关系良好,有较好的精密度和重现性,回收率满足国家标准的要求,检出限和定量限也符合目前三聚氰胺的检测要求,适用于乳制品检测,可作为鸡蛋、饲料等检测参考。