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食品常规理化分析

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主题：【第六届原创】第一次用试剂盒方法（酶法）测定食品中β-葡聚糖含量的体会

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x射线仪器发表于：2013/07/06 20:43:35 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

该帖子已被langhuashang设置为精华；

维权声明：本文为yaofei原创作品，本作者与仪器信息网是该作品合法使用者，该作品暂不对外授权转载。其他任何网站、组织、单位或个人等将该作品在本站以外的任何媒体任何形式出现均属侵权违法行为，我们将追究法律责任。

同样的题目发了两篇，认识的我的人也许以为我突然转了性，为多骗几个积分发灌水贴呢，其实参加原创这么久，写贴都是有感而发，虽然行文随意，但内容绝对真实（发表的论文总要进行一些处理的，你们都懂的），也经常没参考文献（记得我有篇论文只写了一篇参考文献，审稿的硬让我再加两篇），我觉得原创大赛办了这么久，工作人员也都很努力把大赛办成提高专业写作水平的桥梁，这种脱离低级趣味追求高雅的目标，对来追求娱乐精神的网友不知道是否启迪还是遗憾?不过呢，我理解工作人员的良苦用心，这篇写的过程，流水帐信手拈来，完成得会快些，范本贴我会查些资料，补充些实验和数据，所以要慢一点，争取月底前做完吧。

该帖子作者被版主 马踏飞燕加 30积分， 2经验，加分理由：原创先加30分

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2013/7/6 20:49:52 沙发管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

前言

最近我并没改行，只不过单位其它部门的食品项目，开发的是健康食品，顾问是个外请的专家，因为是跟食品开发的人接触的，我就匆匆接触过几分钟，没交换名片，所以也没搞清何方神圣。分析方法是工艺人员给我从日本拿来的试剂盒方法，本来我以为是专家给的，后来才知道在日本搞食品开发的人自己找的。高层领导认为我是搞分析的，这个当然是本行，让我协助做一下，我自己觉得既然方法是国际通行方法，试剂标样什么都全了，那还能有什么问题，所以就满口答应了。没想到带着原有思维去做食品分析，真的遇到了不少问题。

测试内容有很好几个，如葡聚糖、抗性淀粉、植酸/总磷等，都是爱尔兰的Megazyme公司提供的试剂盒，其中葡聚糖的方法基本算是经过了考验，所以我就先写了。

一.葡聚糖试剂盒真容：

β-葡聚糖试剂盒有几种，这个是1，3和1，4的，（我还有一种1，3和1，6的试剂盒，还没来得及做），每个包装做100次。

试剂盒外包装

说明书，全英文

打开就是几个小瓶子，等我知道具体什么东西的时候，觉得太坑了

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2013/7/6 23:41:45 Last edit by yaofei

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2013/7/6 21:52:05 板凳管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

二：试剂和标样

里面有7个瓶子，4个是试剂，瓶子很小，里面的东西更少

Bottle 1. Lichenase 4℃保存3年

Bottle 2. B-Glucosidase 悬浊液，4℃保存3年

Bottle 3. GOPOD试剂缓冲液，4℃保存3年

Bottle 4. GOPOD试剂复合酶，-20℃保存5年

配制方法：

1．取Bottle 1中全量试剂溶解于20mM磷酸Na缓冲液20ml（pH6.5）中，分注至聚丙烯材质的小试管中，-20℃保存，可保存2年以上。

2．取Bottle 2中全量试剂溶解于50mM醋酸Na缓冲液20ml（pH4.0）中，分注至聚丙烯材质的小试管中，-20℃保存，可保存2年以上。

3．取Bottle3中全量用蒸馏水稀释至1L，立即使用。

4．Bottle4的全量用上面的溶液3定容。放置于铝箔遮光瓶中，2-5度保存3个月，-20度保存12个月以上。如果冷冻保存的话，请用瓶分开，冷冻-解冻只能1次。溶液配制时呈浅黄色，4度冷藏2-3个月以上时，颜色变成深粉红色。对蒸馏水的吸光度不得超过0.05。

不是学生物的，搞不清楚这些酶都是啥玩意，不过呢，配起来到简单，20ml就直接用量筒量了，移液管都不用了，就是保存的时候要分开了，免得失效了。

分好了放冰箱里冻着，每次取一个出来用，（A是其他试剂盒用的）
还有3个标样

Bottle 5. 标准D-Glucose溶液，常温保存5年

Bottle 6. 标准大麦粉末，B-葡聚糖含量标识于标签，常温保存5年

Bottle 7. 标准燕麦粉末，B-葡聚糖含量标识于标签，常温保存5年

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2013/7/7 16:09:45 Last edit by yaofei

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2013/7/6 22:03:53 马扎管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

期待楼主完善。原创文章嘛，我也觉得有没有参考文献无所谓，反正又不是在期刊发表文章

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2013/7/6 23:10:14 地毯管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

三、方法
大麦的分析方法（EBC法3.11.1）

1．大麦细细研磨，直至能通过0.5mm的筛子。

2．正确称量大麦粉末，同时测定大麦中的水分含量，使称量的大麦粉末中的干燥重量为0.5g。

3．为了帮助样品很好的分散，各实验管中加入50%乙醇溶液1ml。

4．加入磷酸Na缓冲液（20mM，pH6.5）5.0ml，在试管震荡器上震荡搅拌。

5．放入沸腾水槽中2分钟，然后取出强力搅拌直到没有胶状的凝结。再放入沸腾水槽中3分钟。

6．冷却到40度，各实验管中加入0.2ml Lichenase溶液。试管盖上盖，搅拌后40度1小时培养。

7．各试管加蒸馏水至30.0ml。

8．各试管充分搅拌后，用Whatman No.41滤纸过滤。（或者1000g，10分钟离心）

9．小心得把各滤液放入试管的底部（0.1ml，3个样）。

10．将醋酸Na缓冲液（50mM，pH4.0）0.1ml放入上面3个样中的一个。剩下的2个样中放入B-glucosidase的醋酸Na缓冲液（50mM，pH4.0）0.1ml。各试管40度培养15分钟。

11．将GOPOD试剂3.0ml加入各个试管中，40度下20分钟培养。

12．在510nm的条件下测定吸光度（E_B1）。

燕麦，大麦粉和膳食纤维制品中B-葡聚糖含量的测定（简易法）AOAC法995.16，AACC法32-23

1．燕麦，大麦粉和膳食纤维制品约50g，研磨至通过0.5mm目的筛。

2．样品(80～120mg之间，准确称量)，放入玻璃管中（14×120mm、17ml容量)。轻轻击打试管使样品聚集在试管底部。

3．加入0.2ml50%乙醇溶液，使样品容易分散。加入磷酸Na缓冲液（20mM，pH6.5）4.0ml，试管振荡器搅拌。

4．搅拌后，放入沸腾水槽中，60秒培养。继续用试管振荡器强力搅拌，继续100度2分钟培养，然后再搅拌。

5．50度5分钟培养。

6．各实验管中加入0.2ml Lichenase溶液。试管盖上盖，搅拌后50度1小时培养。培养中3-4次激烈搅拌。

7．各试管加醋酸Na缓冲液（200mM，pH4.0）5.0ml，充分搅拌。

8．放冷至室温（5分钟），1000g，10分钟离心。小心得把各滤液放入试管的底部（0.1ml，3个样）。

9．将醋酸Na缓冲液（50mM，pH4.0）0.1ml放入上面3个样中的一个。剩下的2个样中放入0.1ml B-glucosidase的醋酸Na缓冲液（50mM，pH4.0）。各试管50度培养10分钟。

10．将GOPOD试剂3.0ml加入各个试管中，50度下20分钟培养。

11．在510nm的条件下测定吸光度（EB1）。

涡旋，终于不用我亲自动手了，操作的人没学过分析，也没上岗证，所以呢，光着胳膊还带着东西，不过呢，因为没用什么化学试剂，加上这几天实在太热，我就不责备他了，他手上膏药是打羽毛球拉伤的，可不是做实验受伤的

沸水浴，我记得容量瓶是不能加热的，忘了比色管是不是可以煮的，文中用的是试管，但我不知道按第一篇后面怎么计量到30.0ml，后面一篇不定容，感觉更粗，所以还是用有25ml刻度线的比色管来处理样品了

培养好的，一个空白，两个平行

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2013/7/6 23:11:52 Last edit by yaofei

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2013/7/6 23:30:37 地板管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

四.计算：

翻译的

1．每组分析都要和空白样和50或100ug标准葡萄糖样一起分析。

空白样的配制 0.1ml蒸馏水＋0.1ml醋酸Na缓冲液＋3.0ml Bottle4。

标准葡萄糖溶液配制 0.1ml醋酸Na缓冲液＋0.1ml标准葡萄糖溶液（50ug/0.1ml或者100ug/0.1ml）＋3.0ml Bottle4。

2．各组测定时加一个标准大麦粉末检体。

3．10ug标准葡萄糖的最大发色时间通常为15分钟。

分析方法1：

β-葡聚糖（重量%）＝ΔA×F×300×（1/1000）×（100/W）×(162/180)

＝ΔA×F/W×27

ΔA＝吸光度（反应液）-吸光度（空白）

F＝100（ug葡萄糖）/吸光度（100ug葡萄糖）

分析方法2：

β-葡聚糖（重量%）＝ΔA×（F/W）×8.46

ΔA＝吸光度（反应液）-吸光度（空白）

F＝100（ug葡萄糖）/吸光度（100ug葡萄糖）

在我之前有研发的人员是想自己做的，最后说是看不懂，我想前面步骤应该没啥问题，就在这计算描述有点搞，其实是很简单的，用葡萄糖按最后一步显色，做单点标准曲线，然后算成葡聚糖含量（系数0.9）

单点我总觉得悬,所以把它的葡萄糖标样稀释做成了5个点(含空白)，相关系数0.9999(也是非专业人员做的)，做了几次以后发现稳定性很好，就不再做标准曲线了。不过样品啊，只有3.2ml，10mm的比色皿只够放1次的，你打算让我怎么洗涤啊，还好我在网上2.8元/个的玻璃比色皿买了十个

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2013/7/6 23:40:49 Last edit by yaofei

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2013/7/6 23:34:35 6楼管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

五.感受

1.太简单：只要看懂了说明书谁都会操作，真心觉得还是帮忙就好，要是我天天做这个，会被同行鄙视的

2.太粗：什么分析的手法都变得不重要，定容没了，洗涤也不用了，温度可以40度也可以50度，培养时间10分钟15分钟无所谓，我严格地做和不严格地做，最终结果相对误差都可能达百分之几，不过标样也就标注了两位有效数字，这是常量还是微量分析啊

3.太贵：一套试剂盒几千块，瓶子那么小，里面装的东西还只有几毫升，而且还是溶液，号称做100次，一开始我每个样都要做平行，还有损耗，人家做平行实验一盒很快就完了，不做完也不行啊，放时间长又失效了，关键是我也不知道他们搞啥实验，隔三差五拿来一堆样品，我怎么做都差不多，他们不心疼钱我可是在淌血呢

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2013/7/7 16:13:20 Last edit by yaofei