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主题：【第六届原创】用试剂盒方法(酶法)测定食品中葡聚糖含量(范本贴)

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wanttofly

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x射线仪器发表于：2013/07/06 20:26:28 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

维权声明：本文为yaofei原创作品，本作者与仪器信息网是该作品合法使用者，该作品暂不对外授权转载。其他任何网站、组织、单位或个人等将该作品在本站以外的任何媒体任何形式出现均属侵权违法行为，我们将追究法律责任。

用试剂盒方法(酶法)测定食品中葡聚糖含量

摘要:描述了用试剂盒(酶法)测定食品中葡聚糖含量的方法

前言:

β-葡聚糖是禾谷类植物籽粒细胞壁中的多糖，是籽粒细胞壁的主要成分，化学名称为(1，3)(1，4) -β-D-葡聚糖，其含量以大麦和燕麦中较高其主要功能有：降低胆固醇，降血脂，调节血糖，提高免疫力，抗肿瘤和预防心血管疾病等。还有研究发现，它可以缓解和减轻肥胖症状。

β-葡聚糖测定方法包括酶测定法、荧光法、高效液相色谱法等，其中酶测定法因其反应专一性，测定准确可靠，而被采用为国际测定方法。酶法的方法过程如下：样品经水合和糊化，用地衣酶(β一葡聚糖酶)将样品中的β一葡聚糖酶解成β-葡基-寡聚糖。经调整体积和过滤分离后，用β一葡萄糖苷酶将这些可溶的B-葡基-寡聚糖水解成葡萄糖。葡萄糖用葡萄糖氧化酶氧化成葡萄糖酸和过氧化氢，后者用过氧化酶分解，以便在苯酚存在下，生色基4一氨基非那宗存在下形成适于比色分析的光吸收络合物，在紫外分光光度计下测定。

本文采用爱尔兰的Megazyme公司提供的测定(1，3)(1，4) -β-D-葡聚糖试剂盒，借鉴了EBC法3.11.1、AOAC法995.16，AACC法32-23方法，建立了测定相关制品中β-葡聚糖的测定方法。

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2013/7/6 20:27:05 沙发管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

1实验部分
1.1 仪器与试剂
移液枪：北京大龙兴创，100μL,200μL,1000μL,5000μL
涡旋振荡器：北京大龙兴创MX-F
电热恒温培养箱：上海一恒，DHP9032
离心机：上海安亭TGL-60B
紫外分光光光度计：北京普析通用，UV-1900
试剂盒：megazyme,(1-3)(1-4)β-D-葡聚糖测试盒
醋酸、醋酸钠、磷酸二氢钠、氢氧化钠：均为分析纯
超纯水

1.2实验方法
1.2.1 溶液的配制
a.缓冲溶液的配制

磷酸钠缓冲溶液（20mM,pH=6.5):3.12g磷酸二氢钠溶解于900mL蒸馏水中，再加入100mM(4 g/L)NaOH，将pH调整到6.5，最后定容至1L。

醋酸钠缓冲溶液（50mM,pH=4):2.9mL冰醋酸溶解于900mL蒸馏水中，用1M的NaOH调整pH至4.0，最后定容至1L。

b.反应液的配制：

1#试剂：用20mL磷酸钠缓冲溶液分三次将1#瓶中试剂溶解洗涤转移到小烧杯中，分装到5ml的离心管中冷冻保存，此为地衣酶溶液

2#试剂：用20mL醋酸钠缓冲溶液分三次将2#瓶中试剂溶解洗涤转移到小烧杯中，分装到5ml的离心管中冷冻保存，此为葡萄糖苷酶溶液

3#试剂：用超纯水将3#瓶中溶液溶解洗涤转移到1L的容量瓶中并定容，用该溶液将4#瓶试剂转移到烧杯中，用几个250mL棕色瓶分装，冷藏保存，此为葡糖氧化酶/过氧化物酶试剂混合试剂

c.标准溶液的配制：在3个干净的小样品瓶中分别移取3mL、2mL、1mL醋酸钠缓冲溶液，分别加入1mL、2mL、3mL的葡萄糖标准溶液（4#瓶，浓度100μg/0.1ml)，加上醋酸钠缓冲溶液和原葡萄糖标准溶液，得到浓度分别为：0μg/0.1mL、25μg/0.1mL、50μg/0.1mL、75μg/0.1mL、100μg/0.1mL葡萄糖标准溶液

1.3 标准曲线

在5mL离心管中加入0.1mL醋酸钠缓冲溶液、0.1mL葡萄糖标准溶液、3mL3#试剂，在45度的下培养15分钟，取出，测定510nm下的吸光度，得到浓度-吸光度的标准曲线。

1.4样品测定

(1):将样品研细，并用烘干法测定其水分含量
(2):精确称取0.1-0.2g样品，小心地放入25mL比色管底部
(3):加入1ml50%的乙醇溶液润湿样品后，加入5mL磷酸钠缓冲溶液，涡旋振荡
(4):在沸水浴中加热2分钟后涡旋振荡，继续加热2分钟，继续涡旋振荡均匀
(5):冷却到40度以下，加入0.2mL的1#试剂，放入培养箱，在45度下培养1小时
(6):培养结束后加入纯水至25ml刻度线，混合均匀后，在4000转速下离心10分钟
(7):在3个5ml离心管中分别加入0.1ml的样品上清液，1个作为空白管，加入0.1ml醋酸钠缓冲溶液，另外两个作为样品管，加入0.1mL的2#试剂，在45度下培养15分钟
(8):加入3mL的3#试剂，在45度下培养20分钟
(9):在510nm下用空白值归零，测定样品的吸光度，根据得到的浓度计算出样品中葡聚糖的含量

(10):计算结果：C*0.025*0.9/m*100%（湿基）

如果是要干基就再除以（1-水分%）

2结果与讨论

2.1条件选择：
没钱也没时间去做验证，就把几种标准方法凑了凑，有40度下培养的，有50度下培养的，就选了45度；培养15分钟或20分钟的就选最长的20分钟；
2.2线性：

拿葡聚糖做线性是很好的，第一次做就是0.9999，就是紫外的软件怎么只能选择单位而不能输入呢？没办法，虽然选了单位mg/L，结果还是用excel计算，每次输入样品重量(g),得到的浓度值，用公式算出多少就多少百分含量
比如说0.1982g,得到的浓度值0.9920，结果就是0.992*0.025*0.9/0.1982=11.3%
2.3重复性
重复性分三种:
2.3.1方法中第7步开始的两个重复性：非常好，有时经常一样，偶尔偷懒就取一个做了
2.3.2两个同时处理的平行样：研究人员认为挺准的，自己觉得很是一般。因为试剂盒太贵，时间太长，要用的东西太多，后来我就不重复了，让研究人员说哪个有疑问我就重做，他们基本都说很准，因为一次同样的一个样品两个编号的，一个测出12.4%，一个测出12.7%，他们说很好。
2.3.3长期重复性：当然不是为了论文而作，因为方法要求每次做一个标样，我第一次拿到的方法时8.0%标样就测出8.0%，结果第二次测出了7.6%，我找理由去测了有5%水分，折算成干基为8.0%，第三次拿烘干的标准品测出了8.4%，差点没晕过去，这种重复性是不是太让人崩溃了？

该帖子作者被版主 xuwanxiu2006加 1积分， 2经验，加分理由：补充范本可以参加原创大赛

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2013/7/20 21:13:16 Last edit by yaofei

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2013/7/6 20:27:26 板凳管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

结论：
保存条件很重要，看着说明书一个个对着放，生怕试剂失效。
其实也有文献用类似方法的，但总提到酶必须要纯，于是乎还是信国外的试剂盒靠谱点吧
工作曲线线性很好，重复性不咋地，是个人原因还是试剂或天气原因？研究人员安慰我食品分析要求不高，但愿是真的

参考文献
AOAC 995.16
AACC 32-23.01
EBC 3.11.1

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2013/7/20 21:30:07 Last edit by yaofei