主题：【第七届原创】复杂的检测，多方的合作

复杂的检测，多方的合作

草甘膦又名镇草宁，属于广谱除草剂，对哺乳动物有较低毒性，但长期摄入，危害也很大。现在随着高科技术的大力发展，农业生产的全面爆发，除草剂的用量也越来越大，越来越广泛，这就使得草甘膦成为了河流、湖泊、地下水甚至饮用水的重要污染物。

草甘膦污染越来越被高度重视，草甘膦检测也被频繁提上日程，各级政府机构及各大实验室也紧张密鼓的开发新方法，检测各种相关污染物。

分析草甘膦的方法现在主要有气相色谱法、液相色谱法、气质联用法等，其中液相色谱法应用的最多，最广泛。液相色谱法也有多种检测方式，其中液相色谱法紫外检测器检测和液相色谱法荧光检测器检测应用最为普遍。下面我们就一一介绍下。

我们做这个检测项目是和一地方环保局合作，其中他们提供标准品和水样等，我们提供仪器和检测方法。

相比之下液相色谱法紫外检测器检测相对简单，我们就先介绍这个吧。

大家都知道，色谱分析离不开专业的色谱柱，没有合适的色谱柱色谱分析是很难进行的。对此我们实验室联系了天津博纳艾杰尔科技有限公司（下面简称艾杰尔），说明情况，寻求帮助，经过多番沟通，很快艾杰尔就为我们研发了一款非常优秀的C18色谱柱。有了色谱柱我们大量查阅文献、逐个条件耐心摸索，费尽千辛万苦，终于得到了较合适的检测条件。下面就分享下吧。

检测原理

取适量样品（某自来水），经过滤、浓缩后注入高效液相色谱系统，Venusil SAX（AK）色谱柱分离，紫外检测器检测，保留时间定性，峰面积定量（外标法）计算。

仪器

高效液相色谱仪，包括：高压泵1台，紫外检测器1台，柱温箱1台，自动进样器1台，Venusil SAX（ 5um，100A；4.6 mm x 250 mm ）1根，色谱工作站1套，超声波清洗仪1台，溶剂过滤器1套，固相萃取装置1套，离心机1台，电子天平1台，旋转蒸发浓缩仪1台等。

试剂

甲醇（色谱纯）、0.1mol磷酸二氢钾（磷酸调PH=3.0）、超纯水，草甘膦标准品，AMPA对照品等。

效氯70.9%）、邻苯二醛（OPA)、2-巯基乙醇（MERC）、硼酸、氢氧化钾

标准品溶液制备

    1.草甘膦、氨甲基磷酸（AMPA）标准品溶液：用水配制草甘膦、氨甲基磷酸均为0.1mg/mL储备液。稀释储备液配制浓度为10μg/mL、1.0mg/mL系列工作液。

    2.草甘膦、氨甲基磷酸校准溶液：用0.001mol/L EDTA二钠溶液配制草甘膦、氨甲基磷酸浓度均为0.11mg/mL储备液。稀释储备液配制0、0.025、0.05、0.10、0.50、1.00μg/mL标准系列工作液

样品前处理

如果足够高，样品无需浓缩，微膜过滤后直接进样即可，如果浓度很低时需要对样品进行浓缩。

取500mL水样，若为悬浮液，将样品通过粗滤膜过滤，先取250mL移至500mL圆底瓶中，加5mL盐酸于烧瓶中，5mL盐酸于剩余样品中。在旋转蒸发器中浓缩，缓慢升温从20℃到60℃。在第一部分完全蒸发前，加入剩余样品和2次5ml清洗液，蒸干，若必要，用干氮去除最后的痕量水。取2.9mL流动相（若必要调节PH=2）和0.1mL0.03mol/L的EDTA溶解残留。经0.22μm或0.45μm滤膜过滤，待测。

色谱条件

检测器：紫外检测器

色谱柱：Venusil SAX（ 5um，100A；4.6 mm x 250 mm)

检测波长：195nm

流动相：甲醇：0.1mol磷酸二氢钾（磷酸调PH=3.0）=8:92

流速：1.0ml/min

柱温：30℃

进样量：10ul

草甘膦标准品色谱图：
草甘膦、AMPA混合标准品色谱图：

某水样色谱图：


有人可能会问，这个方法不是检测草甘膦吗，怎么检测过程中出现了氨甲基磷酸（AMPA）。在这说明一下，氨甲基磷酸（AMPA）是草甘膦在某种程度下的代谢产物，水样中只要含有草甘膦就很有可能会含有这种物质，草甘膦含量的计算是这两种物质含量的总和，所以不得不检。

小结：紫外检测器检测水样中农药残留草甘膦，检出限一般为mg/L级别。方法线性、重复性很好，检出限较低，操作方便，结果准确、可靠，方法简单、实用，适合水质中草甘膦快速检测。



下面我们再重点介绍下阳离子交换柱后衍生高效液相色谱法荧光检测器检测水质中草甘膦。

离子交换柱后衍生荧光检测器测定草甘膦的方法比较复杂，尤其是仪器配置方面，造成的检测费用也很高，它的优点是检测灵敏度很高，也就是检出限非常低。

本方法参考了美国EPA方法、GBT 5750.9-2006方法、岛津、天美、美瑞泰克、博纳艾杰尔等公司提供的参考资料，结合了本实验室全体工作人员的集体智慧编制而成。

下面就来看过程。

柱后衍生与荧光检测器结合使得本方法具有很高的灵敏度和选择性。

检测原理

样品经处理后（和紫外检测前处理相同）进入高效液相色谱系统，草甘膦和AMPA经流动相磷酸二氢钾溶液洗脱，在色谱柱中分离。分离后，被分析物通过柱后衍生反应系统，生成的反应产物用荧光检测器检测。

由于每个厂家的仪器的灵敏度各不相同，所以每种方法的进样量也不相同，一般为10-200ul.此方法建议进样量20uL，如图所示，效果很好。

仪器

高效液相色谱仪，包括：梯度泵1套，柱后衍生仪1台（带双注射泵，双衍生池），荧光检测器1台，数据采集器1台，自动进样器1台，柱温箱1台，阳离子色谱柱及保护柱各1根，色谱工作站1套，超声波清洗仪1台，溶剂过滤器1套，固相萃取装置1套，离心机1台，电子天平1台旋转蒸发浓缩仪1台等。

试剂

5 mM 磷酸二氢钾，磷酸调pH 2.0 ；5 mM 氢氧化钾 ；5%次氯酸钠溶液；硼酸钠缓冲稀释剂；OPA（二巯基乙醇），色谱级；甲醇，色谱级；硫醇试剂。

试剂和标准品的准备

氧化试剂(试剂1):

将一瓶次氯酸盐稀释剂倒入预先用甲醇清洗过的干净试剂瓶中。加入100uL5% 次氯酸盐溶液(家用漂白剂)，旋转，混匀，0.45um水系滤膜过滤，超声脱气。加入的剂量可能需要根据检测器的响应进行调整：色谱系统平衡后，草甘膦混合测试溶液进样10uL，如图2所示。如果AMPA和草甘膦的面积比例差别很大，则在氧化剂里面再加入5%次氯酸盐溶液，每次加入20uL，直至二者所占面积比例相当。

OPA试剂(试剂2):

将OPA稀释剂倒入预先用甲醇清洗过的干净试剂瓶中。鼓泡10min以除去其中的氧气。余下的步骤应在尽可能短的时间内完成，因为此试剂对氧气和光敏感：称取大约100 mg OPA于一小烧杯中，加入10 mL甲醇溶解，而后加入OPA稀释剂。用1～2 mL甲醇清洗烧杯，把清洗液倒入稀释剂中。加入2 g硫醇试剂于试剂瓶中。0.45um有机系滤膜过滤，超声脱气，备用。

色谱条件

检测器：荧光检测器

分析柱：草甘膦分析柱，阳离子交换柱，4 mm x 150 mm x 8um

保护柱：草甘膦保护柱，阳离子交换柱，3 mm x 20 mm x 8um

柱温：55 °C

流动相：(A)磷酸二氢钾（5 mM，磷酸调pH 2.0）；(B)氢氧化钾（5 mM）

流速：0.5 mL/min

进样量：20uL

柱后试剂1：氧化试剂，36 °C，流速为0.4 mL/min

柱后试剂2：OPA，室温，流速为0.3mL/min

荧光激发波长为330 nm，发射波长为460 nm

剃度表：

标准品色谱图：

标准曲线绘制

草甘膦标准溶液的浓度分别为0.05、0.5、2、5、10mg/L五个点，标准曲线如图3

样品测试

图4是一种除草剂中草甘膦含量检测谱图。用去离子水稀释该除草剂2500倍，直接进样，这种除草剂中草甘膦的含量大概为1.0%左右。

把该除草剂喷洒到某宽叶草本植物上，约6小时后，取7.0g该草本植物样品充分粉碎，置于具塞离心管中，加入200 mL磷酸钾淋洗液，以5000 rpm离心机离心15 min，上清液过0.45um膜，然后进样，色谱图如图5所示。


某河水样品色谱图：



方法的检测限

空白样品色谱图：



检出限色谱图：


试样中草甘膦20uL进样，方法的检测限为2.0ug/L，比美国EPA 方法和国标方法规定的200uL进样的检测限6ug/L和25ug/L都低，当然这也和仪器的检出限有关。

荧光检测器灵敏度非常高，相比紫外检测器一般会高几十倍到上百倍，是检测含量较低，像农药残留之类样品的理想之选。荧光检测器的灵敏度虽然很高，但采用荧光法需要的仪器配置和实验操作都较复杂，成本也较高。

小结

此方法（阳离子交换柱后衍生高效液相色谱法荧光检测器检测水质中草甘膦方法)线性、重复性很好、检出限很低，这就大大减少了样品浓缩程度的可能；结果准确、可靠，非常适用于草甘膦含量较低的水质检测（也可作为其它检测的参考方法）。

总结

1． 采用荧光检测器检测水质中农药残留草甘膦（也包括其它具有荧光效应或通过衍生化具有荧光效应的样品）含量，最大的优点是灵敏度高；最大的缺点是仪器配置复杂，实验方法复杂，实验所有的试剂多，实验费用高等。

2． 采用紫外检测器检测水质中农药残留草甘膦含量最大的优点是仪器配置相对简单，实验方法相对简单，实验所用试剂相对较少，实验费用相对较低，稳定性、线性相对较好等；最大的缺点是检出限相对较低，含量低的样品需浓缩的程度更高等。

3． 两种方法都可以检测水质中的农药残留草甘膦含量。

4． 紫外检测器检测含量较高的样品效果好些，荧光检测器检测含量较低的样品效果好些。

5． 实验时可根据样品情况（包括样品成分、被测物含量、样品中悬浮物及颗粒物等）和实验室的现实情况（如现有仪器、试剂、前处理设备、操作者能力、实验经费等）选择具体的实验方法，力争花费最小的代价达到最大的收获。

6． 对于像草甘膦这种检测复杂的样品的检测，如果我们实验室检测较困难，我们可以寻求帮助或与其合作，这样可以达到事半功倍的效果。

7． 大家实验室的具体情况都不尽相同，甚至差别很大，以上方法只供参考，如效仿需谨慎。