主题：【第八届原创】谈谈液相色谱方法开发

在沉寂了2年之后，qingqingcao再次探讨高效液相色谱。这次和大家探讨一些关于HPLC方法学开发的问题。当然，这是很久以前的思路，在今天看来是比较幼稚的，但是，如果能够给大家一点哪怕一点点启示也是好的。当然文章有很多缺陷，也希望大家批评。
高效液相色谱在极性的角度可以分成正相色谱分析和反相色谱分析。反相色谱分析一般使用水-甲醇-乙腈体系，一般选用C8，C10，C18 柱子，主要使用C18键合相柱子。非极性物质一般用氯仿-正己烷体系。因为qingqingcao没有做过正相HPLC分离，所以，我们主要关注反相HPLC分析。
色谱柱的选择
当然，选用的色谱柱一般就是C18柱。长度呢？如果分析的物质复杂，那么可以选取长一些的，比如250mm╳4.6mm╳5μm。保证其分离度。 如果物质不是很复杂，那么选取150mm╳4.6mm╳5μm的色谱柱，可以有效地缩短分析时间。
检测器的选择
紫外检测器是最通用的检测器之一，所以，本文均以紫外检测器做说明。对于需要分析的物质，做全波长扫描，由于物质的不同官能团，他们会在不同的地方有吸收。通过综合选取大家都有吸收的波长。选择波长需要有权衡。同时也可以用一些特殊的波长，避免杂质的吸收，也可以提升测试准确度。或者使用双波长的方法。
流动相的选择
对于选取流动相，首先实验一下样品的溶解度。样品在水中，甲醇，乙腈中溶解程度。如果，很容易溶解在水中，这就告诉我们，流动相选取，可能有机相要少些，比方说测试维生素C，其极性很强，流动相中有机相比例不能多。（为了保护色谱柱，有机相比例一般不少于8% ）如果，样品不太容易溶解在水中，那么有机相的比例应高些，比方像维生素E，就可以用90% -95% 的甲醇体系。
其次是样品的酸碱度。我们知道，C18色谱柱流动相pH在2-8 之间。太酸，太碱都可能损坏色谱柱。流动相pH值对于分离有一定作用，所以，酸性物质，一般流动相酸一些，碱性物质可能碱一些。
对于几种物质的分离。如果不是太多的物质，用等度方法会比较好。流动相一般开始选用20mM磷酸缓冲盐-乙腈体系。（pH一定，流速一定）。因为乙腈洗脱好，而且粘度低。通过水相-有机相的比例的改变，观察各色谱峰的分离情况。这样可以运用无限夹逼法找到最合适的值。比方说，35：65（ACN：磷酸盐）达到分离，但是还是有部分叠加，那么就微调即可。当然还要考虑到分析时间问题。不要为了完全分离而牺牲了分析时间。所以，在色谱分析，有一个k值（容量因子）。κ∈（2，20）
如果真的无法改变，那么可以试着微调pH值，来分离。当然，由于乙腈毒性强，所以通过一定计算，用甲醇同等地接替乙腈。

如果有些物质很靠近死体积，那么需要考虑添加0.02mM离子对试剂，加强物质的保留能力。
流速
一般液相流速在0.8-1.4ml/min。首选1.0ml/min
柱温
柱温不影响色谱的分离，但是，相对稳定的温度，可以使得保留时间稳定。
进样量
手动进样，只有进样环。一般也就是20μL。自动进样的选择很多。但是，最好不要超过80μL。因为进样多，容易造成展宽。
分离物质的浓度：
分离物质，不能够太浓也不能太稀。太浓，容易过载；太稀检测不出。具体还是根据检测器的响应来调整。
总结一下
HPLC分析，首先要找到合适的流动相。流动相既要保证分离，又要关心分析时间。流动相尽量使用毒性小一点的甲醇。根据样品和标准品的PH值进行调节流动相溶液酸碱度。
检测波长很重要，要懂得合适的波长。也就是说，这个单一波长可以分析出所有需要分析的物质。可以通过波长的调整，规避杂质峰的干扰。
温度和流速都对分离，影响不大。
分离条件摸索好后，就可以开展
1）线性浓度测试
2）精密度测试
3）样品测试
4）回收率测试
5）空白测试。
6）最小检测限，最小检测量
定量的工作比较简单，就是按照以上的思路去操作。那么一个项目就这么完成了。当然，这些需要我们的工程师们的努力和智慧。
也许，qingqingcao也不再写色谱方面的文章了；因为我没有机会去碰HPLC仪器了。那么，就拿这篇文章作为一个纪念吧。想想从2002年春天，还是一个大学生，去做HPLC，笨手笨脚的，导师也经常批评我。后来又接触了不少的HPLC仪器，也做过维修维护，开发过方法，做过常规工作……这么多年了，一个生手，变成一个熟练工，也能做一点点方法开发，青春就贡献在HPLC上了。看着论坛上有许多HPLC高手，他们的文章，让我觉得，我们时代的发展。后浪推着前浪。后浪必定会超过前浪的。我也希望，我在论坛上写的这些东西，能够给初学者一点点启示，当然，如果有错误的话，希望不会误导大家。如果能够记住qingqingcao做了一点事情，曾经在HPLC上做过点事情，我也欣慰了。也谢谢仪器信息网官人们的努力工作，为我们搭起这样一个平台。