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原创大赛已经接近尾声了,作为一个论坛老人,还是唠叨几点吧。
HPLC,分析行业比较关键的仪器分析,做化学药的,拿到结构式,可能无从下手,不知道分析方法该如何开发,这个也是很久之前自己比较纠结的问题。在此,举一个比较有代表性的简单实例,跟大家分享一下。
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这个化合物在药物合成中作为起始反应物或中间体很常见,Br的对位和间位取代都反应结果至关重要。
间位取代和对位取代化学性质比较相近,HPLC分析方法如何开发?
对于新人来说,比较有挑战性,但是对于老手,相信多数人心中已经有答案了。
首先,了解化合物的化学性质,包括物理溶解性。从结构上看,该化合物偏酸性,溶于甲醇、乙腈等常见试剂,这些最关键的性质决定方法开发的难易。
偏酸性,流动相体系要保证酸性,可以尝试最简单的酸性体系,如0.1%TFA,PH大约在1.93左右。
由于有-COOH,在甲醇体系中可能会发生酯化反应,优先选择乙腈体系。
最大波长吸收,有苯环结构,在210和254nm之间一定有吸收,做一个波长扫描,经过扫描,最大吸收在220nm。
经过上述分析流动相体系和检测波长定下来了。
接下来是选择色谱柱。色谱柱可长可短,可根据自己需要调整,一般先以手头上现有的色谱柱为选择依据,以Xbridge,C18的短柱为例。
上述基本关键参数定了后,就可以尝试开发方法了。
先配制含有间位取代和对位取代的化合物混合溶液,保证在方法中能分离开。
流速和柱温、进样量按基本设定就可以了,一般1.0和25℃。进样量选择10μl。
梯度1:
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先运行一个梯度,考察基本的分离情况,及峰形。按上面梯度,间位和对位的分离度只有1.52,方法有待优化。如下图:
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大方向定了,在此梯度基础上,可以尝试调整,经过几个梯度调整,下面这个梯度比较合适:
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结果如下图:
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从整体上看,该方法作为定量分析可行,接下来做一系列的方法验证,即可作为该化合物对位取代和间位取代的质控分析方法。
上述是工作中很简单的一个化学物的方法开发,实际工作中,遇到的更多比较复杂的结构,基本原则就那么几点,工作积累久了,拿到化合物,感觉就上来了。
国庆前夕,分享一下,希望对新手有所帮助。