高效液相色谱串联质谱（LCMSMS）水蒸气蒸馏法测定食品污染物N-二甲基亚硝胺的含量
摘要：N-二甲基亚硝胺是一种潜在致癌物，对其在食品中的检测和研究，以保障食品安全非常重要，本文建立了液相色谱串联质谱水蒸气蒸馏法测定食品中N-二甲基亚硝胺，样品通过水蒸气蒸馏装置，把分析物蒸馏出来，在通过和二氯甲烷液液萃取，减压浓缩后，采用液质质检测。该方法的定量限1.0μg/kg,仪器在进样体积5μL、1.0~100.0μg/L范围内，线性相关系数大于0.995，在1倍、3倍和10倍定量限添加水平，添加回收率在80%-92%，相对标准偏差（RSD）小于15%,满足检测标准的要求。
关键词：食品；高效液相色谱串联质谱；N-二甲基亚硝胺；水蒸气蒸馏；食品安全
1 试验部分
1.1 材料与试剂：无水乙醇（AR），天津市富宇精细化工有限公司；二氯甲烷（AR），天津市光复材料科技发展有限公司；氯化钠(AR)，江苏强盛功能化学股份有限公司；无水硫酸钠（AR），甲酸（AR），江苏强盛功能化学股份有限公司；天津市富宇精细化工有限公司；浓硫酸（AR）, 青岛世纪星化学试剂有限公司;标准品：N-二甲基亚硝胺标准品（日本东京化成）。
1.2 仪器与设备： LC-MSMS 液相色谱串联质谱仪，waters Xevo TQ-S；氮吹仪：N-EVAP-6;
旋蒸蒸发仪： EYELA N-1100。
1.3 实验方法
1.3.1 LC-MSMS条件
1.3.1.1 液相条件：色谱柱：waters HSS T3 C18 2.1×75mm 1.7μm；柱温：40℃；进样量：5μL；柱压：5000psi；流动相：A: 甲醇；B：0.6%甲酸溶液具体梯度程序见表1：

表1流动相梯度程序

Table 1 Mobilephase gradient program

时间(min)	流速（ mL/min）	A相%	B相%	曲线
Initial	0.4	2	98	Initial
0.4	0.4	2	98	6
2.0	0.4	10	90	6
2.5	0.4	95	5	6
4.0	0.4	95	5	6
4.5	0.4	2	98	1
6.5	0.4	2	98	1

1.3.1.2质谱条件：MS系统： Xevo TQ-S；离子源：APCI正离子模式；电晕针电压：0.6 uA 5.0 kV；萃取锥孔电压(V): 31.00；离子源电压补偿(V): 48.0；离子源温度 (℃): 150；探头温度 (℃): 400；锥孔气流速(L/Hr): 300；脱溶剂气流速(L/Hr):1000；碰撞气流速 (mL/Min): 0.20 ；采用质谱多反应监测(multiple reaction monitoring,MRM) 模式。N-二甲基亚硝胺的最优质谱参数见表2

表2 N-二甲基亚硝胺质谱参数

Table 2N-dimethyl nitrosamine mass spectrum parameters

化合物名称	母离子	子离子	驻留时间（s）	锥孔电压（V）	碰撞电压（V）	备注
NDMA-1	75.2	43.11	0.108	30	11	定量离子
NDMA-2	75.2	58.18	0.108	30	9	定性离子
NDMA-3	75.2	75.15	0.108	30	11	定性离子

1.3.2标准溶液制备
1.3.2.1 N-二甲基亚硝胺中间标准溶液（100mg/L)：准确移取0.1mLN-二甲基亚硝胺标准储备液（1000 mg/L）到2mL进样小瓶中，再加入0.9mL甲醇，得到100.0mg/L中间标准溶液。
1.3.2.2 N-二甲基亚硝胺标准工作液溶液（1.0mg/L）：准确移取0.01mLN-二甲基亚硝胺中间标准溶液到2mL容量瓶中，再加入0.99mL3.5%甲酸溶液，得到1.0mg/L中间标准溶液。
1.3.2.3 系列N-二甲基亚硝胺标准使用液：准确移取0.1mLN-二甲基亚硝胺中间标准溶液（1.3.2.2）到2mL容量瓶中，再加入0.9mL3.5%甲酸溶液，得到0.1mg/L标准使用溶液。按照表3移取适量体积的标准溶液和3.5%甲酸定溶液，制得系列标准使用液。

表3系列标准使用液的配制

Table 3 seriesstandard using liquid

项目	Blank	1	2	3	4	5	6
1.0mg/L移取体积（μL）	0	0	0	10	50	70	100
0.1mg/L移取体积（μL）	0	10	50	0	0	0	0
3.5%甲酸移取体积（μL）	1000	990	950	990	950	930	900
浓度（μg/kg）	0	1	5	10	50	70	100

1.3.3 样品溶液制备
1.3.3.1 试样前处理:取有代表性的样品，打碎混匀。装入样品袋内，样品冷冻保存。
1.3.3.1.1 试样溶液的制备
1.3.3.1.2 蒸馏装置如图1：

图1 水蒸气蒸馏装置

Fig. 1 Water vapor distillation apparatus

1.3.3.1.3 提取：称取粉碎样品200.0g（精确到0.01g，脱水样品称取样品200g。）于1000mL蒸馏瓶中，分别加入100mL纯水、10mL甲酸和50g氯化钠于1000mL蒸馏瓶中，充分混匀，检查气密性。在500mL锥形瓶内加入50mL纯水，放入冰水浴中，冷凝管出口伸入纯水液面以下。开启蒸馏装置。收集到上层液面至400mL位置后，关闭加热装置，停止蒸馏。
1.3.3.1.4 液液萃取净化：把收集的蒸馏液混匀后，取出30mL蒸馏液到50mL离心管内，加入2g氯化钠，涡旋溶解。再加入20mL二氯甲烷，振荡5min，注意放气，静置分层。将二氯甲烷层转移到150mL梨形瓶中，再用20+20+20mL二氯甲烷分三次提取水层，合并四次二氯甲烷萃取液。注意不要移取到上层的水分。
1.3.3.1.5 浓缩：在梨形瓶内加入0.4mL3.5%甲酸，混匀，400hpa,20℃水浴，减压浓缩至近干，加入1.6mL3.5%甲酸溶解残渣，过0.22μm水系滤膜，装入进样小瓶内，LCMSMS检测。
2结果与讨论
2.1 仪器条件的优化
2.1.1流动相及色谱柱的选择：对比了酸性体系（0.1%-0.6%甲酸水溶液）与非酸性体系（1mM-10mM乙酸铵水溶液）分别于甲醇、乙腈的组合，结果发现随着PH值的降低N-二甲基亚硝胺在C18色谱柱上的保留能力越强，响应越高，乙腈比甲醇体系洗脱能力更强。N-二甲基亚硝胺易溶于水为极性很强的化合物，普通C18柱上保留很弱。综合考虑目标物信号强度、信噪比、色谱分离效果及分析时间，本实验最终选择了1.3.1.1方案组合。
2.1.2 质谱条件的优化：分别对比了ESI+^［¹⁵^］和APCI+两种模式条件，发现在APCI源下，目标化合物的信噪比是ESI源下的10倍。
2.2 前处理条件的优化
本实验前处理是在GB5009.26-2016^［¹⁴^］第一法基础进行了以下改进：A、在装有样品的1000mL蒸馏瓶下增加了一个电加热套。B、加热蒸馏前在样品内添加了10mL 88%甲酸。C、蒸馏液接收体积增加到350mL。D、液液萃取后得到的二氯甲烷萃取液在加压浓缩前，加入0.4mL3.5%甲酸水溶液。通过以上改进，获得了更好的回收率。
2.3 定性和定量
2.3.1 定性：以保留时间RT（1.37min）、母离子（m/z: 75.2）及子离子（m/z: 43.109、58.18）碎片进行定性判断。图2是0.005mg/L N-二甲基亚硝胺的标准色谱图

图2N-二甲基亚硝胺标准色谱图

Fig. 2 N-dimethyl nitrosaminestandard chromatogram

2.3.2定量：以43.109作为定量离子，峰面积外标法进行定量。
2.4 方法验证
2.4.1 线性范围：以1.3.2.4步骤配制1.0-100.0mg/L系列标准溶液，仪器在该范围线性关系良好，线性方程为：y=45394.1x+21.6857，线性相关系数(R2=0.9997)大于0.995，见图3。

图3校准曲线

Fig3 calibration curve

2.4.2回收率和重现性：选取烤鱼片、鸡肉粉样品，分别添加1.0mg/L、3.0mg/L、10.0mg/L 3个水平的试验，每个水平做3个平行。数据汇总见表4。方法的回收率在80%-92%，相对标准偏差（RSD）小于15%,满足检测标准的要求。

表4鸡肉粉和烤鱼片样品回收率统计

Table 4 Chickenpowder and the recovery rate of grilled fillet sample statistics

项目	鸡肉粉				烤鱼片
项目	含量mg/kg	回收率%	平均回收率%	RSD%	含量mg/kg	回收率%	平均回收率%	RSD%
样品	0	-	-	-	0	-	-	-
spike1.0mg/kg-01	0.95	95	99	10.2	0.89	89	89	4
spike1.0mg/kg-02	0.91	91			0.85	85
spike1.0mg/kg-03	1.1	110			0.92	92
spike3.0mg/kg-01	2.87	96	94	4.6	2.92	97	97	0.7
spike3.0mg/kg-02	2.9	97			2.88	96
spike3.0mg/kg-03	2.67	89			2.89	96
spike10.0mg/kg-01	8.82	88	90	3.6	8.86	89	88	3.4
spike10.0mg/kg-02	8.9	89			9.1	91
spike10.0mg/kg-03	9.4	94			8.5	85

2.4.3 检测限：以三倍信噪比计算出仪器检测限为0.5μg/L，以10倍信噪比计算该方法定量限为1.0μg/kg。
3 结论综述
本文建立了液相色谱串联质谱法检测食品中痕量N-二甲基亚硝胺含量的分析方法。该方法灵敏度高，定量限1.0mg/kg，能够满足GB2762-2017对食品中限量的要求。同时，采用串联质谱仪具有较高的抗污染能力和准确的定性能力，能够满足肉及鱼制品等复杂基质的定性和定量。