主题：【第十三届原创】离子色谱法同时测定尿液中草酸和硫氰酸盐

中离子色谱法同时测定尿液中草酸和硫氰酸盐

黄选忠

（湖北兴山县疾病预防控制中心，湖北兴山,443711）

摘要：【目的】建立以SH-AC-3型阴离子交换柱为分离柱，离子色谱-抑制电导检测法同时测定尿样中草酸和硫氰酸盐的新方法。【方法】研究用离子色谱法同时测定尿液中草酸和硫氰酸盐的可能性，通过试验优化确定了各项色谱条件。【结果】以SH-AC-3型阴离子交换柱为分离柱，以10.0mmol/LNa2CO3为淋洗液，流量为1.0mL/min，等度洗脱可将草酸和硫氰酸盐与尿液中大量共存的氯化物、磷酸盐和硫酸盐等常见阴离子完全分离，通过抑制电导检测，草酸和硫氰酸盐的峰面积、峰高均与其浓度在0.20～30.0mg/L范围内呈良好的线性关系，相关系数r在0.9991～0.9999，方法应用于尿液中草酸和硫氰酸盐的同时测定，加标回收率在93.2%～105.2%和95.3%～99.8%，， 5次平行测定的相对标准偏差（RSD）小于5%（n=5）。【结论】本方法可用于尿液中草酸和硫氰酸盐的同时测定。

关键词：离子色谱法；尿液；硫氰酸盐；草酸；

中图分类号：O652.63  文献标识码：      文章编号：

尿中硫氰酸盐（SCN-）含量是人体接触氰化物的一项生物接触指标[1]，而SCN-又是致甲状腺肿物质，可阻滞甲状腺激素合成，尤其对胎儿和婴儿的智力和神经系统发育存在较大的风险[2]，因此监测人血、尿等生物标本中的SCN-含量具有重要意义。目前，测定尿中微量SCN-的方法主要有分光光度法[3-5]、衍生-顶空气相色谱法[6-7]等,其中分光光度法和气相色谱法都存在氰化物的干扰问题。尿结石约70%为草酸钙结石，草酸代谢异常所引起的高含量草酸尿是泌尿系结石形成的主要原因[8]。因此准确测定尿中草酸含量对研究结石形成机理、结石的鉴别等均具有重要意义。目前测定尿中草酸的方法主要有光度法包括络合物褪色比色法[9]和催化光度法[10-11]、催化荧光法[12-13]、高效液相色谱法[14-15]和毛细管电泳法[16]等，而比色法、光度法、荧光法等光谱分析方法因特异性差样品要进行前处理，操作繁杂，高效液相色谱法和毛细管电泳法均需要专用仪器使其应用受限。离子色谱法以其操作简便、试剂消耗少、可自动化和多组分同时测定的优势现已成为阴离子分析的首选方法[17]，并成功应用于尿液中草酸[17-18]和SCN- [19-20]的分别测定，用离子色谱法同时测定尿液中草酸和SCN-似未见报道。本工作拟定的以SH-AC-3型阴离子交换柱为分离柱，10.0mmol/LNa2CO3溶液为淋洗液， 1.0mL/min的流量等度洗脱，离子色谱-抑制电导检测法同时测定尿液中草酸和硫氰酸盐的新方法，草酸和SCN-的含量均在0.20～30.0mg/L范围内与其峰高和峰面积呈良好的线性关系（相关系数r在0.9991～0.9999），方法应用于尿液中草酸和SCN-的同时测定，加标回收率分别为：95.0%～101.1%和95.5～100.5%，5次平行测定的相对标准偏差（RSD）小于3%，以3倍信噪比（3N/b）计算草酸和SCN-最低检出限分别为0.04mg/L和0.03mg/L。

1、试验部分

1.1主要仪器

CIC-100型离子色谱仪（青岛盛瀚色谱公司，编号15601），抑制器：自再生抑制器，检测器：电导检测器，定量环体积为25μL；SHA—15自动进样器（青岛盛瀚色谱公司，编号AS1518050）；SH-AC-3型阴离子交换柱（250×4.0mm  i.d,青岛盛瀚色谱公司，批号：1602037）；SH-AC-3型保护柱（50×4.0mm  i.d,青岛盛瀚色谱公司，批号：1602037）。

1.2 仪器工作条件及参数设置

色谱仪：柱箱温度35℃，电流：75mA，量程：1档。

自动进样器：全定量环取样，取样后清洗（每针之间），置换量70μL，取样量25μL，扎针深度4mm。

1.3主要试剂

草酸标准溶液：1000 mg/L，称取优级纯草酸（H2C2O4·2H2O）0.1401g用超纯水溶解定容至100mL；SCN-标准溶液：1000 mg/L，称取烘干的优级纯硫氰酸钾0.1673g用超纯水溶解定容至100mL。Cl-标准溶液：GBW(E)080268，1000 mg/L；SO4-2标准溶液：GBW(E)080266，1000 mg/L；H2PO4-标准溶液：1000 mg/L，称取分析纯磷酸二氢钾0.1402g用超纯水溶解定容至100mL。

用前将各种标准溶液用纯水分别稀释成含草酸和SCN-10.0mg/L（A液）、100.0mg/L（B液）混合标准应用液备用。

无水碳酸钠（分析纯，国药集团化学试剂有限公司），草酸（优级纯，国药集团化学试剂有限公司），硫氰酸钾（优级纯，国药集团化学试剂有限公司）。

试验所用其他试剂均为AR级，试验用水为超纯水（18.2ΜΩ·cm）。

1.4 试验方法

1.4.1 标准曲线的绘制  取混合标准应用液（A液）0.20、0.50和1.00mL及B液0.50、1.0、1.50、2.00和3.00 mL于10mL容量瓶中加纯水至刻度，混匀，配制成含草酸和SCN-均为0.20～30.0 mg/L的标准系列，各管取1.5mL于样品瓶中，启动自动进样器进样分别测定各组分的峰面积（S）和峰高（H），以S及H对各组分浓度(C)绘制工作曲线。

1.4.2尿样的采集  用清洗干净并干燥的聚乙烯瓶采集尿样50mL储存于4℃冰箱待测定。

1.4.3 尿样测定  取新鲜尿样经8000转/min离心10min，取上清液用高纯水稀释10倍后分别用C18柱净化、用0.22μm滤膜过滤后取1.5mL于样品瓶中，启动自动进样器进样测定各组分的S和H，以标准曲线法定量，同时进行加标回收试验。

2、结果与讨论

2.1 色谱条件的选择

2.1.1 淋洗液的选择  试验结果表明，当以SH-AC-3型阴离子交换柱为分离柱，以Na2CO3+NaHCO3溶液为淋洗液,其浓度配比在6 mmol/L+1 mmol/L～6 mmol/L+3 mmol/L时，均可将草酸和硫氰酸盐与尿液中的氯化物、磷酸盐和硫酸盐等常见阴离子完全分离，各组分的分离度R（相对于后续组分，如磷酸盐的R是相对于硫酸盐的，下同）可达1.5及以上，但硫氰酸盐的保留时间（T）长达24min以上，分析效率低下。为缩短硫氰酸盐的T提高分析工作效率，以洗脱能力较强的Na2CO3溶液进行了淋洗试验，结果显示当Na2CO3溶液浓度分别为8.0、10.0和12.0 mmol/L时，硫氰酸盐的T分别缩短至21、20和19分多钟，且草酸和硫氰酸盐与尿液中的磷酸盐和硫酸盐等阴离子完全分离，试验结果见表1。考虑到Na2CO3溶液浓度大，相应的抑制电流也高，不利于抑制器的使用[17]，在保证适宜的R和较短的T的情况下，试验选择10.0mmol/LNa2CO3溶液为淋洗液。

表1  Na2CO3溶液浓度选择试验结果（流量1.0 ml/min）

组分	8.0mmol/L		10.mmol/L		12.0mmol/L
	T/min	R	T/min	R	T/min	R
SO4-2	10.245	3.07	8.606	2.60	7.868	2.34
草酸	13.121	8.15	10.891	9.45	9.828	10.18
SCN-	21.665	/	20.151	/	19.177	/

2.1.2 色谱柱的选择  以10.0mmol/LNa2CO3溶液为淋洗液、流量1.0mL/min等度洗脱，考察了青岛盛翰色谱公司生产的SH-AC-1型和SH-AC-3型阴离子交换柱对草酸和硫氰酸盐与氯化物、磷酸盐和硫酸盐等常见阴离子的分离情况，结果表明，在此条件下SH-AC-1型柱虽能将草酸与常见阴离子完全分离，但硫氰酸盐至少在90min内未出峰，而SH-AC-3型柱不但可将草酸和硫氰酸盐与氯化物、磷酸盐和硫酸盐等常见阴离子完全分离，且硫氰酸盐的T在21min以内，故本试验选择SH-AC-3型阴离子交换柱为分离柱。

2.1.3淋洗液流量的选择  对于相同浓度的淋洗液，不同的流量组分的T和R的将发生改变。试验结果表明，当淋洗液流量从0.8mL/min增加至1.2mL/min时，硫酸盐、草酸和硫氰酸盐的T逐渐变短，R逐渐变小，但硫酸盐和草酸的R远大于1.5达到完全分离的标准，见表2。在保证待测组分与干扰离子完全分离的前提下尽量使用较低的流量，以使系统有较低的压力，淋洗液流量选定为1.0mL/min。

表2  不同淋洗液流量试验结果（10.0mmol/LNa2CO3）

组分	0.8ml/min		1.0ml/min		1.2ml/min
	T/min	R	T/min	R	T/min	R
SO4-2	10.471	2.65	8.726	2.54	7.331	2.46
草酸	13.856	9.34	11.097	9.24	9.540	8.95
SCN-	24.793	/	20.383	/	17.350	/

2.1.4 柱箱温度的确定 考察了柱温在30℃、35℃和40℃时各组分的分离效果，结果显示，在30℃～40℃范围内，草酸和硫氰酸盐均能与氯化物、磷酸盐和硫酸盐等常见阴离子完全的分离，且随着柱温的升高组分的T稍微缩短，R逐渐下降，草酸的S和H均随着柱温的升高而增长，从30℃上升35℃，增长10%左右，35℃上升40℃，增长6%左右；硫氰酸盐的S随着柱温的升高基本保持不变，而其H随着柱温的升高而增长，从30℃上升35℃，增长7%左右，35℃上升40℃，增长9%左右；在保证适宜的T和较高的R的情况下，尽量采用较低的柱温，本试验确定柱箱温度为35℃，这也是产品说明书推荐的柱箱温度。

2.2标准曲线

按照1.4.1配制标准系列，测定各管的峰面积（S）和峰高（H），以S、H对浓度（C）绘制标准曲线，其标准曲线的线性范围、回归方程、相关系数r（回归曲线的截距、斜率和r由仪器软件给出）列于表3。从表3可见，以峰面积计算的草酸标准曲线的线性优于峰高，硫氰酸盐则反之，同时分段计算的标准曲线的线性较好，故在计算结果时草酸和硫氰酸盐可分别用峰面积和峰高计，并根据样品浓度范围采用分段计算的回归方程来计算，以减少测量误差，尤其对低含量的样品。其中，含10.0mg/L的草酸和硫氰酸盐标准溶液色谱图见图1。

表3  标准曲线试验结果

组分	以峰面积计			以峰高计
	线性范围/mg/L	回归方程	相关系数/r	回归方程	相关系数/r
草酸	0.20～10.0	S=96700C-17000	0.99957	H=3320C-770	0.99930
	10.0～30.0	S=112800C-177600	0.99996	H=3862C-6116	0.99993
	0.20～30.0	S=107100C-53210	0.99929	H=3671C-1995	0.99928
SCN-	0.20～10.0	S=114600C+621.7	0.99913	H=2718C-108.6	0.99999
	10.0～30.0	S=124700C-141500	0.99971	H=2934C-2787	0.99984
	0.20～30.0	S=119200C-22340	0.99949	H=2835C-609.3	0.99972

2.3 方法的精密度和检出限

对2种浓度的标准溶液各平行测定5次，计算各成分峰面积的RSD，同时测定仪器30min的基线噪声，以3倍基线噪声除以标准曲线（峰面积计）的斜率（3N/b）计算草酸和硫氰酸

图1 标准溶液色谱法图

盐的检出限，5次平行测定的RSD在0.86%～2.26%，方法的重复性良好，方法的检出限分别为0.04 mg/L和0.03 mg/L，见表4。

表4 方法的精密度和检出限

组分	标液1			标液2			检出限/mg/L
	浓度/mg/L	平均峰面积	RSD/%	浓度/mg/L	平均峰面积	RSD/%
草酸	1.00	78077.3	2.10	10.00	955086.6	0.86	0.04
SCN-	1.00	116110.4	2.26	10.00	1146968.6	1.16	0.03

2.4 共存阴离子及抗坏血酸的影响

由于尿液中含有大量的有机物和氯化物、磷酸盐和硫酸盐等阴离子，尿样通过C18柱的净化可以消除有机物的影响，尿液经10倍稀释以降低氯化物、磷酸盐和硫酸盐的影响。考察了氯化物等3种阴离子对草酸和硫氰酸盐测定结果的影响，结果表明，氯化物、磷酸盐和硫酸盐的保留时间远小于草酸和硫氰酸盐，且500mg/L Cl-、300mg/L H2PO4-、SO4-2（H2PO4-、SO4-2完全分不开合并为一个峰）不影响50mg/L的草酸、3mg/L的测定，分离色谱图见图2。

图2 常见阴离子与草酸和硫氰酸盐分离色谱图

尿液中可能含有抗坏血酸，在碱性条件下，抗坏血酸易发生降解反应，而草酸是抗坏血酸的降解产物之一，影响草酸的准确测定，有研究显示在15.0mmol/LNaHCO3溶液(pH=8.3)中40mg/L的抗坏血酸在80min内未降解为草酸[17]，本试验使用10.0mmol/LNa2CO3溶液（pH≈11.1）为淋洗液，pH值远大于8.3，样品从进样到草酸出峰需要11min多钟，这段时间尿液中的抗坏血酸可能降解生成草酸而影响其测定。试验用纯水配制30mg/L的抗坏血酸观察其降解情况，结果表明，本试验条件下30mg/L的抗坏血酸降解产生约0.3mg/L的草酸，试验采用亚硫酸盐（SO3-2）抑制抗坏血酸的降解，这与在易氧化药物制剂中加入亚硫酸盐以提高药物稳定性的方法有相似原理。

图3  抗坏血酸降解抑制试验结果

曲线1、30mg/L抗坏血酸（黑色）2、1+50 mg/L的SO3-2（粉红色）

              3、30mg/L抗坏血酸+10mg/L草酸（蓝色）4、3+50 mg/L的SO3-2（桔红色）

试验结果显示，50mg/L的SO3-2可抑制30mg/L抗坏血酸的降解，见图3，且至少在120min内30mg/L抗坏血酸对10.0mg/L的草酸的峰面积与峰高无明显影响（增加值<5%）。同时50mg/L的SO3-2对草酸和硫氰酸盐的测定结果无明显影响（误差<5%），见图4。

图4  50mg/L的SO3-2对草酸和硫氰酸盐测定结果的影响

曲线1、10mg/L草酸和硫氰酸盐（蓝色）

    2、1+50 mg/L的SO3-2（粉红色）

2.5尿液测定及回收率试验结果

按试验方法1.4.3的步骤操作取1.5mL样液于样品瓶中，启动自动进样器进样测定各组分的峰面积（S）和峰高（H），以标准曲线法定量，同时进行加标回收试验。3份尿液草酸和

表5 尿液测定及回收率试验结果（以峰面积计）

组分	尿液1			尿液2			尿液3
	本底/mg/L	加入量 /mg/L	回收率/%	本底/mg/L	加入量/mg/L	回收率 /%	本底 /mg/L	加入量 /mg/L	回收率 /%
草酸	4.71	10.0	101.1	6.21	5.0	97.0	14.83	2.0	95.0
SCN-	0.21	10.0	100.5	0.45	5.0	97.2	0.72	2.0	95.5

硫氰酸盐的测定结果分别在4.71mg/L～14.83mg/L和0.21mg/L～0.72mg/L，加标回收率分别为：95.0%～101.1%和95.5～100.5%，结果见表5。其中尿液2的加标色谱图见图5.

图5 尿液2及其加标色谱图

曲线1、尿液

                  2、尿液加5mg/L草酸和硫氰酸盐

3 小结

本工作采用国产离子色谱设备，建立了以青岛盛翰色谱公司生产的SH-AC-3型阴离子交换柱为分离柱，10.0mmol/LNa2CO3为淋洗液、流量1.0mL/min等度洗脱，抑制电导检测-离子色谱法同时测定尿液中草酸和硫氰酸盐的分析方法。方法具有良好的重现性和准确性，操作简便快速，尿样通过C18柱的净化可以消除有机物的影响，尿液稀释10倍后可降低氯化物、磷酸盐和硫酸盐的影响。方法以自动进样器进样，降低检验人员的工作强度，提高了工作效率，适用尿液中草酸和硫氰酸盐的同时测定。

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