（1）RIPA裂解液的配置：正常购买的裂解液中分别加入0.1%、2%、4%和8%的SDS，配置系列RIPA裂解液。

（2）将提取的外泌体溶液加入等体积的蛋白裂解液在冰浴上进行裂解。为了使其充分裂解，每5 min振荡一次，共裂解50 min。随后加入4×蛋白变性缓冲液，100℃煮沸5 min，将变性的蛋白样品放入-20℃冰箱中保存备用。

蛋白浓度的测定

首先，将上述外泌体裂解后的蛋白原液于4℃以12000 rpm离心15 min，弃去沉淀。取15 μL上清液与45 μL PBS缓冲液混合（稀释4倍）配置蛋白稀释液。然后用PBS缓冲液稀释BSA标准蛋白溶液，配制终浓度为0 mg/mL、0.025 mg/mL、0.05 mg/mL、0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.3 mg /mL、0.4 mg/mL、0.5mg /mL的蛋白溶液。以A液：B液=50：1的浓度配制工作液。最后，将上述配制好的标准蛋白和蛋白稀释液20 μL加入96孔板中，每孔加入200 μL工作液，设置3个复孔，吹打混匀，避免出现气泡。将锡箔纸覆盖的96孔板放入37℃恒温箱孵育30 min。酶标仪的检测波长设置为562 nm，检测各孔的OD值。根据酶标仪算出的标准蛋白拟合曲线计算蛋白原液的浓度。

Western blotting

（1）10%分离胶的配置

将玻璃板清洗干净后组装起来，加入适当的三蒸水，20 min后，观察液面是否下降，来检查装置是否紧密。待玻璃板干燥后按比例配置分离胶：4 mL去离子水；3.3 mL 30%丙烯酰胺；2.5 mL pH=8.8 Tris-HCl；100 μL 10 % SDS；100 μL 10% APS；4 μL TEMED。将分离胶混匀后加入玻璃板中，在该过程中应避免产生气泡，随后在玻璃板中加入适量的酒精压平界面，待30-40 min后，分离胶凝固，倒掉上层酒精。

（2）基层胶的配置

待玻璃板干燥后加入已配置好的基层胶（2.7 mL去离子水；670 μL 30% PAGE；500 μL pH=6.8 Tris-HCl；40 μL 10% SDS；40 μL 10% APS；4 μL TEMED），立刻插入梳子，避免产生气泡，等待基层胶凝固。

（3）电泳

清洗并组装电泳装置，固定SDS-PAGE凝胶，倒入配置好的1×电泳缓冲液（14.4 g 甘氨酸，3 g Tris，1 g SDS，加入去离子水，搅拌溶解，定容至1000 mL）。拔出梳子，用20 μL移液枪吹打每个加样孔以去除杂质，用40 V电压电泳20 min疏通每个泳道，关闭仪器。然后按照试验要求加入变性后的目的蛋白和蛋白Marker，样品的两边可以加入1×上样缓冲液进行补齐。打开仪器开关，将电压调至60 V进行电泳，当溴酚蓝到达基层胶和分离胶的连接处，将电压调整到90 V继续电泳，直至溴酚蓝跑到接近底部。电泳结束后，拆除装置，取出凝胶，切除多余的部分备用。如需考马斯亮蓝染色，将凝胶放入考马斯亮蓝染色液中，摇床振荡30 min后，用蒸馏水洗涤3次后放入洗脱液中进行洗脱。

（4）转膜

配置1×转膜缓冲液（14.4 g 甘氨酸，3 g Tris，150 mL 甲醇，加入去离子水，搅拌溶解，定容至1000 mL）。将适当大小的PVDF膜放入甲醇中激活5 min，随后放入转膜液中。转膜夹白色面朝下放入转膜液中，然后放入泡沫层、3层滤纸、激活后的PVDF膜、切好的胶、三层滤纸和最后一个泡沫层。在上述过程中应保证每层均无气泡存在。将装置放入转膜槽中，转膜液中可以加入小冰袋，防止转膜过程中温度过高。将装置放入冰盒，恒流200 mA进行转膜，转膜时间由目的蛋白的分子量所决定。

（5）封闭和免疫反应

转膜结束后，将膜和含5% BSA的TBST溶液放进封闭盒中，室温摇床慢摇2 h。随后TBST洗3次，每次10 min。配置适合比例的一抗溶液，将膜放入其中，4℃摇床孵育过夜。第二天，TBST洗3次，每次10 min，在室温下摇床孵育二抗1 h，随后TBST洗3次，每次10 min。

（6）显影

避光配置ECL发光液。将发光液滴加到膜上，避光孵育3 min，放入预冷后的发光板上，调整膜的位置，用BIO-RAD凝胶成像仪显影并拍照。

外泌体的成功捕获进一步通过Western blotting进行验证。HSP70、CD63、TSG101和CD81是四种典型的普遍存在的外泌体标记蛋白。通常这些蛋白在整个细胞上清裂解液中的表达水平极低。然而，通过所开发的Tim4@ILI-01免疫亲和材料富集后，这四种蛋白质均可以被显著识别（图3-7）。以上结果进一步表明所开发的Tim4@ILI-01免疫亲和材料可用于成功捕获外泌体。

恭喜您！提交成功

主题：【第十四届原创】外泌体蛋白质的提取