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主题：【分享】单细胞凝胶电泳步骤

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发表于：2012/05/05 12:43:31 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
单细胞凝胶电泳步骤：
1. 分离制备单细胞悬液：
（1） 体外培养的细胞株：用胰酶消化，最后用PBS悬浮吹打成单细胞悬液，细胞要计数，具体的量我前边已经说过。
（2） 体内脏器细胞：处死动物，取出脏器，于Hanks’液中制备成单个细胞悬液。
2. 胶板制备：
（1） 取100μl于45℃水浴中保温的0.5%NMA，铺于磨沙载玻片上，形成底胶。盖玻片推匀，不能有气泡，4度凝固5至8分钟。
（2） 水平取下盖片，取100μl于37℃水浴中保温的0.5%LMA与20μl细胞悬液（约400个细胞）混匀，立即铺片，加上盖玻片，4度凝固5至8分钟。
3. 细胞裂解与电泳：
（1） 将制备好的胶板去掉盖玻片后，浸于4℃预冷的细胞裂解液中，在4℃下裂解2.5到3小时。
（2） 取出胶板，用双蒸水浸没漂洗后放入电泳槽中，浸泡在4℃预冷的电泳液中解旋20分钟。
（3） 玻片水平放置阳极端附近，4℃电泳20到25分钟（25V，300mA）。可在电泳槽周围加冰块以保持低温。
4. 中和与染色：
（1） 电泳结束，将胶板浸泡于中和液中，每次10分钟，共中和3次，每次要更换中和液。最后晾干。
（2） 取出胶板，置于染色缸中，在2μg/ml的EB染色液中，暗处染色5到10分钟。
（3） 蒸馏水漂洗2次，每次5分钟。
稍晾干，滤纸吸去多余水分，尽快在荧光显微镜下观察。
从胶板制备开始到最后都应该在暗光下操作。
先讲这些，你们可以先开始摸索，真正做了才能发现具体的问题，到时我们再探讨。
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