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主题：【分享】胶回收的方法、注意事项以及实验步骤

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发表于：2012/05/05 12:25:41 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
DNA片段的分离与回收是基因工程操作中一项重要的技术,如可收集特定酶切片段用于基因克隆或是制备探针,回收PCR产物用于再次鉴定等。

1 各类常用回收方法

由于分离方法众多,且各种不同的方法可能同时依据多项原理,所以只能粗略地将各种方法分成五大类:电泳法,收集孔法,机械破碎法,溶(熔)胶法与酶处理法:


一,电泳法

根据凝胶割否分透析袋法与流动电洗脱法(割胶),滤纸-透析膜法与DEAE膜法(不割胶).


(1)透析袋法
该方法可回收大于5kb的片段,缺点是操作麻烦并易造成DNA酶的污染.

(2)流动电洗脱法

该方法回收片段大小为4～50kb,且回收效率高达94～100%,极端条件下可回收大至550kb的片段.缺点是操作繁琐,而且为了取得较高的回收率,需特定的流动电洗脱槽.


(3)滤纸-透析膜法

回收率平均达70%左右,不需割胶,操作相对简单,但实验中需将滤纸上的DNA洗脱,也较繁琐,也不易控制.


(4)滤纸-透析膜法

此方法用于回收小片段,一般小于5kb的片段回收效率较高,可达70%以上;对于大片段(>15kb)则难以从DEAE膜上洗脱下.
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2012/5/5 12:26:23 沙发 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
二,收集孔法

(1)蔗糖法
回收小片段效率较高,564bp的PCR产物带回收效率高达97.6%,并且回收中能将较宽的条带浓缩于收集孔中,但回收中制作收集孔较麻烦,并且收集孔中要加入蔗糖,故获得的DNA样品不能直接用于后续实验

(2)羟基磷灰石法
该方法回收效率也较高,不利之处与上述方法相同,获得的DNA需再纯化,操作也较繁琐.
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2012/5/5 12:27:07 板凳 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
三,机械破碎法

指用机械力将凝胶压碎后再行回收DNA片段,有冻挤法,冻融法,压碎浸泡法,(单层)滤膜过滤法及双层(亲和)膜过滤法.
(1)冻挤法
将胶条割下置于塞有玻璃棉的吸嘴或是管底刺有小孔的eppendorf管中,冰冻30min后全速离心5min,收集清液,再经酚抽提,乙醇沉淀等纯化浓缩处理(也可直接沉淀).其基本原理理是利用离心力将凝胶中原有的液体挤出,同时也带出胶中的DNA.从胶浓度为1%琼脂糖中回收650bp,1.1kb,2.0kb,4.5kb的片段时,回收率分别为90%,74%,56%,30%.这是因为大分子DNA更难于被胶中的缓冲液带出,所以此法只适用于回收较小的DNA片段.


(2)冻融法
割下的胶条放在eppendorf管中,将之捣碎并放于-80℃冰冻5min,取出后迅速放置于37℃保温10min,如此反复3次能使DNA从胶中游离出来,离心获得上清中即含有目的DNA,可通过沉淀浓缩获得高浓度.对一般的DNA片段回收效率在60～80%.操作简单,并不需特殊设备. k{Aj


(3)压碎浸泡法
又称醋酸铵法,操作较费时,回收效率较低,一般改良的方法是在冻挤法操作中,加入一定的水并浸泡10min,增加DNA的回收率.
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gl19860312
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2012/5/5 12:28:09 马扎 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
四,溶胶法

根据物理或化学溶胶可分为低融点法(物理熔胶)与NaI,KI,NaClO4溶胶法(化学溶胶).


(1)低融点胶法

采用特殊的低融点凝胶,该胶在65℃即溶化,实验中是先灌制正常的凝胶,然后用低融点胶取代其中的部分(即可节约低融点凝胶用量,也能保证电泳中整块凝胶的完整性.)电泳完成后割下的凝胶可于65℃下保温溶解,后直接用于酶切,连接,DNA标记的实验.操作方便简单,但需特殊的低融点凝胶,成本较高,且回收得到的样品浓度较低.

(2)化学融胶法
琼脂糖能溶解于一些盐溶液中(NaI,KI,NaClO4),然后可用特殊的纯化柱将DNA样品溶液纯化,现在广泛使用的凝胶电泳中DNA片段回收试剂盒基本采用了此中回收原理,能在短时间内获得目的DNA片段,成本也较低. 


五,酶处理法
对于大片段DNA的回收,象酵母人工染色体的克隆实验中,克隆片段可大到2 000kb,一般采用此方法.利用琼脂糖酶降解琼脂糖,能较温和的裂解琼脂糖,最终成功回收DNA片段.
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2012/5/5 12:30:45 地毯 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
3 实验步骤


一、试剂盒法(Kit回收法,以上海申能博彩生物科技有限公司生产的试剂盒为例)

(1)从电泳板上切割含目的DNA片段的凝胶块(割胶尽可能的小,提供后续回收效率)

(2)凝胶称重后并将其放入1.5ml管中,将其适当切小,加速溶解.每100mg凝胶加入400μl solution SN.(若称重省略,一般加入400μl SN)

(3)凝胶溶解:55-60℃,保温5-10分钟,每2分钟混匀一下,使凝胶溶解,胶完全融化后每400μl solution SN中加入solution B 100μl,混匀.

(4)将3S柱装入2ml洗管,将上述混合液转移至3S柱,室温放置2min.室温10 000 rpm离心1分钟,稳定45秒.

(5)取下3S柱,倒掉收集管中的废液,将3S柱放入同一收集管中,加入600μl Wash Solution,室温10 000 rpm离心1分钟.


(6)重复步骤5一次.


(7)取下3S柱,倒掉收集管中废液,将3S柱放入同一收集管中,室温10 000 rpm离心2分钟.


(8)将3S柱放入新的离心管中,在3S柱子膜中央加30μl ddH2O,不加盖室温放置2分钟.

(9)盖上离心管,室温10 000 rpm离心1分钟,离心管中的液体即为回收的DNA片段.

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2012/5/5 12:31:28 地板 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
二、冻融,挤压回收法


(1)用手术刀在DNA紫外检测仪下切割下含有所要DNA片段的凝胶块置于Eppendorf管中,甩至管底,-20℃冻存30min,


(2)取出后用牙签将凝胶块尽量捣碎,剪去管上部,用烧红的针头在管底扎几个微孔,孔径越细越好.


(3)将管套入另一个Eppendorf管中,常温下,15 000rpm离心10分钟.


(4)将上清液吸到收集管中,向沉淀中加入100μl重蒸水.


(5)重复步骤(2),(3),(4)两遍(如图所示).


(6)收集的上清于15 000rpm,4℃离心20分钟,吸取上清液,补足400μl.


(7)收集的上清液加入0.1V 的KAc(pH=5.5,3M)和2.0～2.5V 的无水乙醇,充分混匀后-20℃放置30min,取出15 000rpm,4℃离心30min.


(8)弃上清,加入400μl 70%的乙醇,15 000rpm,4℃离心5min.


(9)弃上清并倒扣3~5min,然后37℃烘干(30min左右即可).

(10)烘干沉淀可用30ml ddH2O溶解,待用.
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