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主题：【分享】用变性梯度凝胶电泳、PCR及GC发夹检测突变

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发表于：2012/05/05 12:14:42 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

变性梯度胶凝电泳(DGGE)能够将具有单个碱基差别的DNA分子分离开来。分离以 DNA在溶液中的解链特性为基础。以温度或变性剂浓增高时，DNA分子在不同的区域相对应的解链温度称为基础。解链区域的长度从25个碱基对到数百个碱基对不等，与每一个解链区域相对应的解链温度称为解链温度(Tm)。由于一个DNA链上相邻碱基间的堆积作用在DNA双螺旋的稳定上起着相当重要的作用，因此解链区域的Tm值主要取决于的序列。既使是很小的变化也会引起DNA片段Tm值的改变，如单碱基替代可引起1.5℃的差异。在DGGE系统中，DNA片段在变性剂梯度聚丙烯酰胺凝胶中电泳，凝胶中自上而下所含变性剂浓度呈线性增加。DNA片段在进入变性剂某一浓度时，此浓度下DNA片段在最低温度解链区域解链(相当于该区域的Tm值)，此时DNA分子成分枝状结构，它使DNA分子在胶中的移动减慢。如果梯度条件选择恰当，因单个碱基变化使不同的DNA片段在凝胶中的不同位置分叉，随后DNA片段移动减慢，从而使笪DNA片段最终分离开来。

DGGE可以用来检测除最高温度解链区域以外的所有发生单个碱基变化的DNA片段。例如一个DNA片段有三个解链区域，其中头两个区域中的碱基变化能够检测到；但是最后一个区域的碱基变化，由于缺乏完全解链区域时依赖序列移动的DNA片段，一般不能检测。我们能够利用克隆的DNA片段通过一个富含GC片段与有两个解链区域的 DNA片段结合来解决这一困难，富含GC的片段我们称之为GC发夹。当缺乏GC发夹时，只有那些发生在此DNA片段第一个区域所发生的单碱基变化可用DGGE分开；而GC发夹与该DNA片段结合能够区分第二区域所发生的单碱基改变。\par我们对GC发夹的研究最初是通过将突变的DNA片段克隆入一个质粒载体，使其与一个含80%鸟嘌呤与胞嘧啶的 300bp片段连接，并用限制性内切酶隆解此克隆DNA，使之释放出与GC发夹结合的靶片段。虽然该方法是行得通的，但是要设计一个适合于直接检测基因组DNA片段、特别是带有长达300bp的GC发夹的片段仍然存在着困难。克服这个困难的第一步是有关的实验观察以及理论推算，结果表明GC发夹长为30bp就足能用于绝大多数DNA片段的 DGGE分析。第二步进展在聚合酶链反应(PCR)基础上，设计一方法使短的GC发夹与DNA 基因组结合。该方法是根据一篇报道，即有限制性内切酶位点的DNA短片段能够与寡核苷酸相连，此寡核苷酸用于PCR扩增DNA片段；这些在DNA基因组织中未编聯的寡聚核苷酸的wè5'尾斣陂织PCR过程中有效地掺入扩增的DNA片段的5'末端。我们最近将该原理用于DGGE方法，结果表明长40-45bp的GC发夹能够与来源于人基因组的扩增DNA片段结合，此GC发夹能检测发生单个碱基变化的DNA片段，而当其缺乏GC发夹时，DGGE检测不到。PCR扩增过程中DNA片段的大量扩增增加了灵敏度，所以只需少量DNA样品，经EB染色的DNA可以很容易地检测出来，因而不需使用放射性探针。因不需与放射性探针杂交，此法也能比较容易地检测低、中和高拷贝数的重复序列，而这些序列用 Southern杂交来分析有时是十分困难的。在此将详细描述本方法的实验过程，并且专门讨论该方法如何用于完整的从短到中等长度的基因的分析。

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2012/5/5 12:15:24 沙发管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

策略
利用PCR扩增基因组或者克隆的DNA样品，两条寡核苷酸链与DNA的两侧相结合。其中一条链的5'末端附加40-45nt的GC富含序列；该5'末端结构在PCR过程中掺入扩增的DNA片端的5'末端。扩增的DNA片段在对待测DNA浓度合适的变性剂梯度胶中电泳，凝胶用EB染色、紫外检测。因突变或中性多态性而具有一个碱基差别的DNA片段在凝胶中迁移到不同的位置，经EB着色呈现不同的带。
在开始使用PCR/GC发夹方法前有几个方面需予以考虑。如下面将要讨论的，尽管可用DGGE检测和1000bp的DNA片段，但该方法检测500bp和更短的DNA片段更为有效。在PCR扩增以及DGGE过程中，可用几种不同的方法来选择寡核苷酸以达到最佳实验结果。此外，有三种不同的方法来决定对于每个扩增DNA片段最佳的变性梯度以及电泳时间。 @

寡核苷酸的设计
在使用PCR/GC发地，必须选择用来扩增靶DNA的两个寡核苷酸。一般扩增最好是选择长度在100-500bp之间的DNA片段。之所以选择范围的DNA片段因为用DGGE检测长于500bpDNA片段时，突变型和野生型分子之间的分辨率会下降；此外，超过几百个碱基对的DNA片段在聚丙烯酰胺凝胶电泳中移动非常缓慢，走电泳的时间太长，因此用 PCR/GC发夹的方法来检测几个kb的全基因，我们建议设计几对寡核苷酸将此基因扩增成几个带有重叠的DNA片段。虽然用PCR可同时扩增多个片段，但扩增临近片段时应小心避免产生不必要的复合体产物。因此，为了达到最理想的结果，每一对引物应分别用于不同的PCR反应。但是通常可根据DNA片段的解链特性在DGGE之前、PCR扩增之后将两个或多个片段混合，只用单孔胶分析多个片段。

根据DNA片段的核苷酸序列[6，7，14，15]，有可能推知它的解链特性；并且根据推论选择寡核苷酸的位置以便合成适合于DGGE的DNA片段。当然，也可以简便、有效地选择靶片段而不用推知解链特性，选择扩增DNA片段的寡核苷酸并且在PCR扩增后选择最佳的DGGE分析条件。下面将提供有关使用上述简便方法的具体建议：

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2012/5/5 12:16:04 板凳管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

1、选择两个相对长度为20-25nt的核苷酸序列作为特异的引物通过PCR合成靶片段。理想的引物核苷酸序列应该最少有50%G+C，并且不应该有间接重复序列。

2、设计两个PCR引物，其中一个有额外的40个100%G+C核苷酸附加在5'末端作为GC 发夹。解链推测以及我们的经验表明任何随机的GC序列都能达实验目的。当然有几个建议可以避免一些问题。避免在GC发夹序列中的重复延伸，此重复结构在PCR过程中形成干扰引物与模板退火的二级结构。同时在设计的GC发夹引物中，最好C碱基经G碱基要多，并且使引物中的连续的G碱基减至最低。之所以如此，是因为寡核苷酸合成仪合成含有少数相邻G碱基的引物产量很低。之所以如此，是因为寡核苷酸合成仪合成含有少数相邻G碱基的引物产量很低。只要每个PCR反应分别进行，在每组引物中利用相同的GC发夹序列都能得到满意的结果。我们曾用6个不同的GC发夹序列成功地扩增出了几个不同的DNA片段。其中一个序列如下所示:
5'CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGCCCC 3' h\3-8 m
该序列在3'末端接上长20-25核苷酸特异序列，此序列可与基因组DNA中的靶片段区退火。虽然我们在该GC发夹中间加入了一个T碱基，因其会使Tm值降低，所以建议不要采用此形式；我们建议使用含100%G+C的发夹，发夹顺序如上所示或类似。根据序列的解链计算以及我们使用6种不同的GC发夹的经验，表明一个长40核苷酸的发夹最为有效。因此超过该长度的发夹就没有必要。虽然短于40核苷酸的GC发夹与一些DNA 片段结合也有效，但它们对其他一些片段就不那么有效；因此，我们不主张使用少于 40个核苷酸的GC发夹。

3、对于大多数DNA片段，只需在其中一个的末端具有单一的GC发夹。有关的解链预测以及某些实验表明GC发夹附着于DNA片段的两个末端并增加在DGGE上识别碱基的分辩率。虽然我们还未扩增用两个分别含不同的GC顺序的寡核苷酸来扩增长达1000bp 的DNA片段，但仍有可能办到，然后用限制性内切酶消化扩增的DNA片段使其酶切位点差不多位于DNA片段的中间位置，产生两个含GC发夹的片段。使用该方法可能存在的问题在于两个GC引物在PCR过程中可能彼此干扰。

4、我们用变性的聚丙烯栈腕凝胶电泳纯化用于PCR的寡核苷酸引物；然而有些纯化对于特异制备的引物可能是不必要的。因为含有GC-发夹的引物至少长60个核苷酸(40 个核苷酸的GC发夹与长20个核酸的特邓列结合)，制备物通常含有干扰PCR结果的较短寡核苷酸；这些片段很容易经制备电泳而除去。纯化之后，引物要经过酚抽提乙醇沉淀及TE缓冲液悬浮(10mMTris.HCl.pH8.0，1mMEDTA，)，使其终浓度达10pmol/μl

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