一、原理

1.多糖的分级与纯化

多糖纯化的实质是将粗多糖中的杂质（包括蛋白质、色素、低聚糖、无机盐等非糖物质）除去而获得分子量和极性均一的多糖组分。比较常用的方法有：醇沉法、超滤法和柱层析法等。其中柱层析法应用比较普遍，多用于样品的精细分级,具有操作简单，重现性好的优点，但样品上样量小。用于多糖分离的柱层析主要有两类：一类是通过分子量大小进行分级的凝胶柱层析，如Sephadex G-100（200、50、25、10）、SepharoseCL-6B等系列；另一类是离子交换层析，是根据多糖所带电荷的性质不同选择相应的离子交换柱对多糖进行分级。如待分离的多糖带有负电荷，可选择阴离子型的DEAE-纤维素柱或DEAE-Sepharose柱进行分级，以获得均一的多糖组分。

通过热水煮提方法提取的多糖，通常是混合物，且分子量不均一，其单糖组成、分子结构和聚合度往往不同，可通过柱层析的方法，对其进行分级以达纯化的目的。本实验中，采用DEAE-纤维素柱层析的方法对中草药中水溶性粗多糖进行分级纯化，分离纯化出各级分多糖，为后续研究多糖的结构特征和生物活性奠定基础。

2.苯酚—硫酸法

游离的寡糖、多糖中的己糖或糖醛酸在浓硫酸的作用下，脱水生成糠醛，再与苯酚作用起显色反应，在一定范围内其颜色深浅与糖的含量成正比，吸收值与糖含量呈线性关系。且己糖在490 nm处（戊糖及糖醛酸在480 nm）有最大吸收，故用比色法测定多糖含量。该法简单，快速，灵敏，且颜色持久，同一台设备同一光源仅需制作一条标准曲线。

二、步骤

1.中草药水溶粗多糖的提取流程

中草药粉末®蒸馏水浸泡过夜®超声/微波®水浴浸提®过滤去除药渣®定容®多糖含量测定

加等体积95%乙醇®4℃冰箱过夜，醇沉多糖®5000r/min离心去上清液®粗多糖®脱蛋白®脱色素®透析®浓缩®冷冻干燥得水溶多糖®DEAE-纤维素色谱柱®收集多糖组分®测定每50s洗脱液的OD值®绘制横坐标为管数与纵坐标为OD值的洗脱曲线

根据洗脱曲线收集多糖溶液®4℃无水乙醇醇沉过夜®离心®多糖沉淀®常规干燥®纯度鉴定®纯多糖

2.脱蛋白

由于粗多糖中含有一定量游离的和结合的蛋白，为保证多糖的纯度，必须将蛋白质脱去。常用的脱蛋白方法有Sevag法、三氯乙酸法和蛋白酶法（如链蛋白酶、胰蛋白酶、木瓜蛋白酶）等。

（1）Sevag法

根据蛋白质在有机溶剂（如氯仿）中易发生变性析出的特点，把多糖配制成5%的糖液，然后按照1:3的体积比加入Sevag试剂（氯仿∶正丁醇=4∶1），混匀后剧烈振荡，静置分层后吸去水层与溶剂层交界处的变性蛋白质，重复操作多次，直到除尽蛋白质为止。

（2）三氯乙酸法

将粗多糖配成5%的糖液，加入30%三氯乙酸溶液，使三氯乙酸终浓度为15%，在4℃冰箱中放置过夜，离心弃去沉淀，得无蛋白的多糖溶液，再用1 mol/L NaOH溶液中和至PH为7。

（3）蛋白酶法

将粗多糖配成5%的糖液，用酸碱调pH至中性，加链蛋白酶0.5 L，放恒温箱中37℃保温24 h后，加热升温至80℃使酶失活，离心，得无蛋白的多糖溶液。

3.脱色

（1）活性炭法

将脱蛋白后的多糖配成5%的糖液，用NaOH溶液调pH为4.5，加入活性炭粉末，于80℃保温2 h后过滤。反复进行3次，直到溶液颜色不再降低为止。

（2）过氧化氢法

将脱蛋白后的多糖溶液，用浓氨水调至pH为8.0，逐滴滴加20%H₂O₂至溶液为浅黄色，50℃水浴，保温2 h后过滤。

4.透析脱盐

将脱蛋白、脱色后多糖配成5%溶液，置于透析袋中，先用自来水逆向流水透析72 h后，再用蒸馏水透析24 h，每4 h换水一次。

5.干燥

将脱蛋白、脱色、脱盐后的中草药多糖溶液，水浴80℃浓缩至10 mL，加三倍体积的无水乙醇过夜，离心取沉淀，经无水乙醇、乙醚洗涤后，常规干燥得中草药去蛋白去色素的多糖。

6.多糖含量测定

采用苯酚-硫酸法测定样品中的多糖含量。绘制标准曲线，根据葡萄糖标准曲线和样品吸光值计算其糖含量。

标准曲线的制作：准确称取105℃干燥恒重的标准葡萄糖50 mg定容于500 mL容量瓶中，加水至刻度，用移液管分别吸取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mL转入试管中，各以蒸馏水补至1.0 mL，每个浓度重复四个平行。然后分别向每支试管中加入4%苯酚试剂1mL及浓硫酸2 mL，摇匀，沸水浴中煮沸10 min，冷却至室温，放置10 min后在λ= 480 nm处测定吸光值A。以吸光值A为纵坐标，糖含量C为横坐标，得糖的标准曲线。

样品溶液制备：精密称取水溶性粗多糖5 mg，先加10 mL蒸馏水溶解，然后定容至50 mL。

样品含量测定：用移液管吸取样品液1.0 mL，加入4%苯酚溶液1 mL及浓硫酸2 mL，按上述方法进行操作，测其吸光值，以标准曲线计算样品糖含量

按下式计算中草药多糖的质量浓度与得率。

7.分级

（1） DEAE-纤维素的预处理和装柱

将DEAE-纤维素用蒸馏水充分浸泡溶胀后，倾倒除去水分，再用0.5 M NaOH溶液浸泡1 h，用蒸馏水反复洗涤至PH等于7。再用0.5 M的HCl溶液浸泡1 h，用蒸馏水洗至中性，真空清除气泡，备用。

装柱时，先将DEAE-纤维素沿着玻璃棒缓慢倒入，以防产生气泡。柱子装好后，依次用5倍柱体积的蒸馏水、3倍柱体积的1.0 M NaCl和5倍柱体积的蒸馏水进行平衡，流速设定为20 cm/ h。

（2）水溶性粗多糖的离子交换柱层析的线性梯度洗脱

称取50 mg水溶性粗多糖，溶于5 mL蒸馏水中，在已平衡好的DEAE-纤维素离子交换柱（1.5 × 14 cm，Cl^-型）上进行上样，先用100 mL蒸馏水做流动相进行洗脱，再用0~1.0 M NaCl溶液300 mL进行线形梯度洗脱，流速1.0 mL/min，每个试管收集3 mL洗脱液，苯酚—硫酸法测定洗脱液中相对的糖含量分布。

8.纯度鉴定

（1）高效液相色谱法

采用高效液相色谱仪系统， 10A检测器，CLASS-Vp工作站，TSK-gel G-3000PWXL不锈钢色谱柱（7.8 × 300 mm)，柱温为40℃。

取各级多糖样品溶于0.7 M Na2SO4溶液中，其多糖终浓度为2 mg/mL，上样20 μL，流动相为0.7 M Na2SO4溶液，流速为0.5 mL/min。

（2）紫外光谱分析

将水溶性粗多糖各级分多糖样品配成0.1 mg/mL的溶液，用752PC型紫外可见分光光度计于200-400 nm处扫描检测。

（3）旋光仪分析

不同的多糖具有不同的比旋度，它们在不同浓度的乙醇中具有不同溶解度，所以，如同一多糖水溶液经不同浓度的乙醇沉淀所得的沉淀物，具有相同比旋度，则证明该多糖为均一组分。

将评估多糖样品溶于水，成为近似半饱和溶液，置于磁力搅拌器上，在搅拌下加乙醇，使溶液中乙醇浓度达到20%，搅拌片刻，使沉淀完全，离心得沉淀。上清液中再继续滴加乙醇，使溶液中乙醇浓度达40%，所产生的沉淀再经离心。前后两次沉淀，分别干燥后在相同条件下测定其水溶液的比旋度。

将10 mL5%饱和糖液用国产WXG-6型自动旋光仪，钠灯光源，以蒸馏水调零点，1dm管室温下测定。