主题：【第十六届原创】氟苯尼考胺流动相优化过程记录

氟苯尼考胺流动相优化过程记录

由于氯霉素逐渐在畜禽养殖中被禁用，氟苯尼考作为其替代品，近年来广泛用于治疗猪、禽及鱼类的肠道及细菌性呼吸道感染疾病。研究表明，氟苯尼考在动物组织中其代谢物经水解后最终会转化为氟苯尼考胺，因此原来只检测氟苯尼考含量不能完全反映该类物质在生物体内的残留情况，需要增加氟苯尼考胺残留量检测（以氟苯尼考和氟苯尼考胺含量之和计）才能更全面反映氟苯尼考是否残留超标。

氟苯尼考、甲砜霉素、氯霉素三者都需要用液相色谱串联质谱ESI^-负离子模式检测，而氟苯尼考胺需要用ESI⁺正离子模式，因此同时检测这四种物质就存在需要在一个质谱方法里完成正负离子模式的切换，对流动相要求也不一样——正离子模式加酸有利于离子化，负离子模式加酸可能会抑制离子化。

方案1：考虑到氟苯尼考胺是在原来氟苯尼考、甲砜霉素、氯霉素三种负离子模式检测方法的基础上新增加的组分，所以优先考虑了原来的液相方法（流动相用纯水+乙腈），氟苯尼考胺纯溶剂标色谱图如图1，保留时间在1 min左右，能和后面的三种负离子模式组分采集时间分开；但配制基质标再进样就发现样品空白基质对氟苯尼考胺产生特别大的干扰，严重影响定性定量分析，纯水+乙腈流动相组合显然不能满足分析要求。

图1

图2

方案2：液质对流动相要求比较苛刻，酸、碱、盐必须是易挥发的物质，所选范围比液相色谱方法少的多，方案1流动相行不通，考虑在无机水相中加入0.1%甲酸，得到图3的色谱图。由于氟苯尼考胺含有NH₂官能团，极性强，加酸更易形成正电荷准分子离子峰——加入甲酸后氟苯尼考胺响应值确实比方案1高一些。但随之带来的问题是保留时间大幅度提前，并且峰型出现拖尾、分叉情况，并随着进样针数增多峰型越来越差，不少带有NH₂官能团极性强的物质在酸性条件下都或多或少存在这种现象，一般液相色谱解决方案是加入三乙胺等碱性“扫尾剂”使目标物尽量保持分子状态增加保留时间以改善峰型，但三乙胺在液质流动相中属于禁用物质（若流动相中使用三乙胺正离子模式会出现102超高响应值的背景离子，且很难清洗干净），虽然不能添加三乙胺，但给了我们提示——加入相应易挥发的碱性流动相也能起到“扫尾剂”的作用。

图3

方案3：根据方案2的提示，试验在无机水相中添加一定比例的氨水，纯溶剂标样得到如图4的色谱图——峰型对称、保留时间合适（能和后面负离子模式采集时间分开），图5的基质标色谱图显示干扰物质也能和目标物完全分离，因此使用氨水+乙腈流动相能满足实验条件。进一步研究发现，氨水的加入量多了（＞0.1%）会严重抑制氯霉素等三种负源物质灵敏度，经过多次试验最终确定加入0.05%氨水能很好的兼顾氟苯尼考胺的峰型和三种负源组分的响应值，最终氟苯尼考胺、氟苯尼考、甲砜霉素、氯霉素这四种组分同时分析选用的流动相方案为0.05%氨水溶液+乙腈梯度洗脱程序，分离度、灵敏度都能达到相应的标准要求。

图4

图5