主题：【分享】木香靶向PKM2缓解溃疡性结肠炎

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发表于：2024/09/09 17:00:23 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

炎症性肠病(inflammatory bowel disease，IBD)是一种慢性复发性肠道疾病，主要分为克罗恩病(Crohn's disease，CD)和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis，UC)。UC的特征是结肠和直肠的持续性和特发性炎症。UC的标志性病理特征包括始发于直肠并向近端延伸的持续性炎症，累及黏膜层，常伴有溃疡、出血和黏液过度分泌。在过去的三十年中，UC的发病率和患病率在世界范围内呈上升趋势。随着时间的推移，UC患者常常面临可导致病情恶化或并发症的危险因素。这些危险因素可能导致结肠的结构和功能损伤，包括结肠动力障碍、良性狭窄和肛门直肠功能障碍。尽管UC的病因尚不清楚，但目前的认识表明，失调的免疫反应、炎症、遗传倾向、环境因素和生活方式的影响都有助于其发展。最近的研究强调了免疫细胞在UC发生发展中的作用。UC患者肠道中存在大量的免疫细胞，如T细胞、B细胞和巨噬细胞。它们在UC的发病机制中起重要作用，分泌炎性细胞因子如TNF-α和IL-12，导致肠黏膜炎症。调节性T细胞(Treg)和辅助性T细胞17(Th17)在UC的免疫病理机制中发挥重要作用，两者相互作用，维持平衡。Th17细胞在自身免疫性疾病的发病中起重要作用。Th17细胞分泌的IL-17A和IL-22等促炎细胞因子在肠道炎症和组织损伤中发挥重要作用。在UC患者中，肠黏膜中Th17细胞的增加与这些细胞因子水平的升高相关，反映了疾病的严重程度。相反，Treg细胞主要负责维持自身耐受和防止自身免疫反应，通过分泌细胞因子(如TGF-β和IL-10)和直接抑制效应T细胞发挥其抗炎作用。同时，Treg细胞抑制Th17细胞的分化和功能，维持平衡的免疫应答。在UC患者中，这种平衡被打破。Treg细胞的功能失调会削弱其充分调节Th17细胞的能力，而环境紊乱，如肠道菌群失调和持续感染，以及遗传因素，可能会加剧Th17细胞的活化。然而，恢复两者的平衡可以减轻IBD患者的症状和改善病情。因此，调节Treg和Th17细胞之间的平衡可以作为IBD的治疗策略。木香是菊科植物木香的干燥根，为《中国药典》收载的传统中药，临床上用于治疗消化系统疾病。前期研究表明，AR提取物可显著减轻乙醇和幽门结扎诱导的急性胃损伤大鼠的胃黏膜损伤。此外，AR通过抑制炎症反应和调节胆汁酸受体表达来改善胆汁淤积性肝损伤。然而，AR治疗肠道炎症的潜力及其潜在机制仍有待进一步阐明。本研究采用光交联靶标钓取技术确定了M2型丙酮酸激酶(pyruvate kinase isozyme type M2，PKM2)是AR的直接靶标，缓解葡聚糖硫酸钠(dextran sulfate sodium，DSS)介导的UC小鼠的肠道炎症并调节免疫平衡。

实验结果1：木香（AR）减轻了DSS诱导的UC小鼠肠道损伤

为了阐明AR在结肠炎中的潜在治疗作用，用3%DSS给小鼠灌胃构建IBD动物模型。首先，利用HPLC-DAD分析了AR的含量，发现其主要成分为《中国药典》中所规定的木香烃内酯和去氢木香内酯。DSS给药7天后，小鼠体重急剧下降，腹泻、直肠出血和DAI评分显著增加((图1B-D))，而AR治疗(75和300mg/kg)剂量依赖性地保留了DSS介导的小鼠的这些变化。

给予AR缓解了DSS介导的UC小鼠的结肠出血、结肠长度的缩短和MPO水平的增加。H&E染色结果表明，AR治疗剂量依赖性地改善了DSS介导的UC小鼠中大量炎症细胞的聚集和肠隐窝的褪色(图1I)。这些结果表明AR缓解了DSS引起的小鼠肠道病变和炎症的发生。

实验结果2：木香（AR）改善DSS诱导的UC小鼠肠道屏障功能和炎症反应

肠道紧密连接蛋白ZO-1和occludin在维持肠道健康和阻止肠道细菌进入体循环的肠道屏障中起关键作用。因此，检测了给予AR(75和300mg/kg)后，DSS介导的UC小鼠中ZO-1和Occludin的水平。免疫组化ZO-1和occludin染色结果表明，DSS暴露抑制了它们在结肠组织中的表达，AR处理增强了它们在DSS介导的结肠组织中的表达(图2A和B)，Western blot的结果证明了这一点()。还分析了促炎和抗炎细胞因子的水平，包括IL-6，TNF-α，IL4和IL-10。值得注意的是，AR治疗导致DSS介导的UC小鼠IL-4和IL-10升高，IL-6和TNF-降低。以上结果表明，AR保护了肠道上皮细胞在肠道中的通透性和屏障功能。

实验结果3：木香（AR）降低DSS诱导的UC小鼠巨噬细胞和中性粒细胞的募集

巨噬细胞和中性粒细胞是固有免疫的重要成员，共同参与机体抗感染和维持组织稳态的过程。在UC的发生发展过程中，它们被大量募集到炎症部位，它们的激活和细胞因子的释放加重了肠道组织的炎症和损伤，因此，它们已成为疾病严重程度的指标。如图3A所示，DSS诱导了巨噬细胞在肠道炎症部位的聚集，而AR减少了巨噬细胞的浸润。进一步通过CD11b和F4/80(巨噬细胞的两种标记物)染色进行流式细胞术分析巨噬细胞。DSS诱导的小鼠肠道CD11b+F4/80+阳性细胞数从4.11%增加到14.4%，而AR处理后，这种变化被逆转(图3B和C)。同样，用其标记物Gr-1染色的DSS诱导的中性粒细胞的聚集被AR处理逆转，流式细胞术的结果证明了这一点()。这些结果提示AR对UC中巨噬细胞和中性粒细胞的募集具有抑制作用。

实验结果4：木香（AR）通过阻断NF-κB和NLRP3信号通路发挥抗炎作用

炎症性肠病(IBD)是由于肠道炎症和溃疡形成导致肠黏膜层破坏而引起的疾病。炎症是导致疾病发生和发展的主要原因之一。NF-κB通路是参与调节细胞活化和分化的重要炎症通路。RT-qPCR实验结果显示，DSS诱导TNF-α、IL-6和IL-1α的mRNA表达水平增加，而AR处理逆转了这些变化(图4A)。此外，AR下调与NF-κB通路相关的关键蛋白p-IKKβ、p-IKBα和pp65()。

NLRP3炎症小体在对抗肠炎和肠癌的发生中发挥重要作用，并通过激活caspase-1切割促炎前体pro-IL-1β参与炎症的调节，因此评估AR是否抑制NLRP3的激活。图4D显示，DSS处理后，红色荧光(NLRP3)增加，而在AR给药中，红色荧光(NLRP3)减少，Western blot结果证明这一结果。在IL-1β的mRNA水平也观察到类似的结果(图4F)。综上所述，AR通过阻断NF-κB和NLRP3通路减轻DSS诱导的肠道炎症。

实验结果5：木香（AR）通过调节Th17和Treg细胞的平衡来调节DSS诱导的小鼠免疫

先前的研究报道了Th17和Treg细胞在DSS介导的IBD中的关键作用，因此使用流式细胞术通过染色标记CD4，CD25，IL-17A和Foxp3来分析Th17和Treg细胞。流式细胞术结果显示，DSS处理后，脾脏中CD4+IL-7A+Th17细胞从4.83%增加到27.00%，脾脏中CD4+CD25+Foxp3+Treg细胞从18.80%减少到8.86%，而AR剂量依赖性地逆转了这些变化。RORγt和Foxp3分别是Th17和Treg细胞的特异性转录因子，负责促进其分化和功能，调节IL-17a和IL-10的水平。Western blot和qPCR结果证明了AR的调控作用，证明了流式细胞术的结果。

肠系膜是支持和保护肠道的重要结构，参与肠道免疫反应。我们试图研究AR是否调节肠系膜中的T细胞。AR下调MLN中Th17细胞相关基因(IL-17a与RORc)的表达，上调Treg细胞相关基因(IL-10和Foxp3)的表达。同样，在DSS诱导的结肠中，AR对RORt和Foxp3的蛋白和mRNA表达也有同样的影响(图6B和C)。总的来说，AR通过调节Treg和Th17细胞来维持肠道免疫平衡。

实验结果6：PKM2是AR的直接细胞靶点

为了发现AR的潜在作用靶点，基于光交联技术设计合成了探针ARHPM。随后，pull down结果显示在58kDa处有明显的差异条带，LC-MS分析显示为PKM2，进一步用其特异性抗体进行Western blot验证。此外，CETSA和DARTS的结果表明，在温度和链霉蛋白酶的作用下，AR对PKM2的去稳定作用，这证明了PKM2和AR结合的存在。

为了证实AR通过PKM2发挥抗炎和免疫调节活性，于是建立了LPS诱导的RAW264.7细胞炎症模型。如图8A所示，AR抑制了LPS诱导的炎症因子(如NO、IL-6、TNF-α)的释放，证实了AR在体外具有抗炎活性。接下来，明确了PKM2与AR抗炎作用的关系。为此，对PKM2进行了敲低，并通过qPCR和Western blot进行了验证。进一步通过qPCR实验检测IL-6、Mfn1、Opa1、IL-1β和Drp1的mRNA水平。正如预期的那样，PKM2敲低减弱了炎症基因的表达，而在AR处理后无显著差异。此外，进一步研究了AR对DSS诱导的小鼠结肠和脾脏中PKM2相关下游蛋白(如LDHA和GLUT1)的影响。如图8E和F所示，观察到与对照组相比，DSS诱导的小鼠中LDHA和GLUT1的增加，在AR给药后下调。总的来说，AR通过靶向PKM2发挥其保护作用。

IBD是一种慢性肠道疾病，可导致肠道组织损伤和溃疡，对人类健康构成严重威胁。在这项工作中，AR增加了体重，并改善了DSS诱导的小鼠腹泻、直肠出血和结肠长度。此外，AR抑制NF-κB和NLRP3通路，减少抗炎因子IL-6、TNF-α和IL-1β的释放，从而减轻炎症反应。AR可减少肠道巨噬细胞和中性粒细胞的积聚，通过调节Treg和Th17细胞维持肠道免疫平衡。利用光交联靶标垂钓技术确定了PKM2是AR的潜在靶标，CETSA、DARTS和PKM2敲低实验进一步证明了这一结论。这些发现表明PKM2在UC和AR中的作用，可以作为开发PKM2调节因子的候选者。

AR，又名木香，是《中国药典》收载的传统中药，具有补肠止泻的功效，临床上广泛用于治疗各种消化系统疾病。最近，AR的各种成分被报道具有多种药理作用，包括抗菌、抗病毒、抗炎和抗肿瘤作用。AR已被证明可以通过减少炎症因子或抑制细胞凋亡，改善胃部组织病理学条件，从而显著减轻胃溃疡的严重程度。有研究者证实，AR通过抑制NF-κB通路有效改善5-氟尿嘧啶诱导的小鼠胃肠道毒性，临床上用于预防化疗期间的肠黏膜炎。木香烃内酯作为AR的主要活性成分，已被证实可通过NLRP3、NF-κB、STAT1/3、Akt和HIF-1α通路调节炎症和免疫(Th17分化)，改善DSS诱导的结肠炎。同样，本研究发现AR通过抑制IKKβ/NF-κB和NLRP3来抑制肠道炎症，调节Th17和Treg细胞的平衡，从而缓解UC的病程。

药物靶标是与疾病的发生、发展密切相关的特异性分子，能够与药物相互作用从而达到治疗效果。药物靶标的识别和验证是新药研发的关键步骤。中药靶点的发现方法主要包括生物素标记策略、亲和层析、蛋白芯片和各种组学技术。近年来，出现了许多无标记的靶标发现方法，包括CETSA、DARTS、代谢组学、转录组学和蛋白质组学等。除上述外，光交联靶标钓取技术已成为研究生物分子结构和功能、识别生物活性化合物靶标、确定配体-靶标复合物的选择性和亲和力的最有力的策略之一，通过将二氮杂环丙烯、苯叠氮、芳基酮和重氮引入到小分子药物中。例如，Jiang课题组通过引入炔基化二苯甲酮构建了小檗碱的光亲和探针，以识别EIF2AK2为其直接靶标，使其具有抗炎作用。此外，Yang等在毛喉素中引入光亲和基团二氮杂环丙烯，发现毛喉素可以变构激活转谷氨酰胺酶2诱导成骨细胞分化。本研究利用光交联技术构建了探针AR-HPM，并揭示了AR的靶标为PKM2，CETSA、DARTS和PKM2敲低实验的结果证明了这一点。

PKM2是哺乳动物细胞中存在的4种PK异构体之一，在多种生物学途径中发挥重要作用。以往对PKM2的研究主要集中在其对肿瘤细胞代谢的影响，而其作为细胞病理生理活动的关键调节因子的意义在免疫和炎症过程中的作用越来越被认识。PKM2通过增强促炎细胞因子IL-1和TNF-的水平来促进先天性免疫应答。PKM2表达降低可能阻碍糖酵解，促进Treg细胞分化，降低Th17细胞分化水平。此外，有证据表明，在炎症条件下，PKM2可能参与负反馈调节，抑制Foxp3并发挥Treg细胞功能。因此，PKM2作为促炎介质表达和分泌的关键调节因子而出现，表明其有可能成为炎症和免疫相关疾病的治疗靶点。本研究中PKM2被确定为AR的潜在靶点，以对抗UC相关的肠道炎症，并维持肠道免疫反应的平衡。

AR靶向PKM2抑制NF-κB和NLRP3通路，从而调节炎症反应和免疫，缓解DSS诱导的UC。这些发现提示了AR在UC治疗中的潜力，AR可作为开发PKM2调节因子的候选药物。

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