主题：【资料】欧盟兽药检测方法（之十一）

放射免疫法测定肉、牛奶和蛋中的氯霉素残留量(EEC, 筛选法)

RIA Screening Method for the Detecion of Chloramphenicol in Meat, Milk and Eggs (EEC, Sg3.3 Screening Method)

安全操作注意事项及急救
实验中使用有机溶剂时按潜在危险品处理规定操作，并在通风橱内进行。
引言
氯霉素(CAP)是具有广谱性作用的抗生素，作为兽药用于家畜疾病的预防和治疗。欧盟(EEC)在CVMP决议中规定不允许在蛋鸡和乳牛中使用。
1 主题内容
欧盟(EEC)对氯霉素制定了全面限制使用的规定。为了确保农场主在蛋鸡和乳牛中不再使用氯霉素，同时为了对动物源肉品中氯霉素的监控,因此从饲养场和屠宰场抽取的样品进行 筛选检测的目的，制定了本法。一旦筛选呈阳性，必须进一步检验确证。
2 应用范围
本法用于肉、牛奶和蛋中氯霉素残留量的鉴定。方法检测限：牛奶和蛋，1 g/L或1 g/kg；肉10 g/kg.
3 参考文献
Commission Decision 93/256/EEC,laying down the method for detecting residues of substances having a hormonal or thyrostatic action [OJ.NO.L.118,14.4.93 PP 64-74]
ISO Standard 78/2-1982 layout for standards Part 2:Standard for chemical Analysis ISO Standard 5725(1986)
Radioimmunoassay for the measurement of chloramphenicol residues in eggs, milk and meat.(1993)
Bundesgesundheitsampt, Berlin
Arnold, And, lst Draft of the summary report of EEC Collaborative study “chloramphenical Methods ”,July 1987-February 1988.
Arnold D, Vom Berg D, Boertz, A. K, Mallik, U. and Somogyi, A.(1984), Radioimmunologische Bestimmung Von Chloramphenicol-Ruckstanden in Musculatur, Milch und Eiern, Archiv, Fur Lebensmittel Hygiene, 35, 121-148
Prei B. A, Balizs, G07 Bensch-Girke Th, Gude, A, Boenke, A. and Kroker, R, (1993)Preparation of reference materials for chloramphenicol in muscle and milk-date on puality criteria,In Proc.Euroresidues ⅡConference, Veldhoven NL. Vol. 2.558-562
4 定义
氯霉素含量是指按本法测得的肉、蛋和牛奶中氯霉素的量，以 g/L或 g/kg表示。
5 方法提要
本方法包括三个步骤
──样品用乙酸乙酯提取；
──提取物用液－液分配法净化(对于牛奶样品用固相(SPE)净化法)
──用放射免疫法(RIA)进行检测和宣量。
6 材料
6.1 试剂
注意：所有试剂均为分析纯
6.1.1 乙酸乙酯
6.1.2 甲醇
6.1.3 三氯甲烷
6.1.4 正已烷
6.1.5 乙腈
6.1.6 异辛烷
6.1.7 氯化钠
6.1.8 乙醇 (绝对保证分析纯)
6.1.9 绵羊白蛋白()
6.1.10 磷酸氢二钾
6.1.11 磷酸氢二钠
6.1.12 叠氮化钠
6.1.13 活性炭 Norit A pract
6.1.14 葡聚糖,分子质量大约70000道尔顿(Pharmacia 1702800)
6.1.15 水相液配制的闪烁液(Beckmann 270453721A)
6.1.16 氯霉素()
[注意：放射性标记的氯霉素(CAP)(6.1.17)和抗血清(6.1.18)可从BGA(Berlin)购得。
6.1.17 放射性标记的丙酰氯霉素，3-羟基-3-(4 -硝苯基)-2-(N /3H/丙酰基)-氨基丙烷1-醇，放射量，61 Ci/mmol (2.26TBq/mmol),TRQ5394，(由BGA特约合成)。所提供的产品为在乙醇中为14.47 ci/mL。贮存于－20℃下。
6.1.18 氯霉素单抗血清(BGA)
61.19 蒸馏水
6.1.20 冰
6.2 氯霉素标准品
6.2.1 标准溶液；氯霉素标样配于乙醇中,浓度10ug/ml贮于4℃，至少可稳定6个月。
6.2.2标准工作溶液用磷酸缓冲液(6.3.1)稀释,得到浓度为10, 25, 50, 100, 125, 250, 500, 1250, 2500ng/mL。改溶液限制一周内使用.
[注意：方法性能考察采用20个校正点]
6.3 溶液
6.3.1 磷酸盐缓冲溶液,PH7.45。3.4g KH2PO4, 3.55g Na2HPO4和0.5g叠氮化钠溶于950毫升水中。调节pH至7.45,再用水定容至1升.
6.3.2 抗血清预稀释液1/200 (W/W) ；含2.5 mg/mL羊单抗血清(6.1.18)的磷酸缓冲液,贮存于-20℃。
如果抗血清为冷冻干燥形式(BGA提供)则按如下操作：
──将管子离心，以免损失
──加1mL水
──在4℃下振荡过夜使其重组。
6.3.3 抗血清工作液 1/75000 (w/w)；取部分抗血清预稀释液(6.3.2)，稀释375倍，贮于＋4℃。
6.3.4 放射配体工作液,取部分放射性标记的同素物(6.1.17)用磷酸盐缓冲液稀释,得到1.08纳摩尔浓度的溶液,当用配制贮存于4℃,限制一周内使用。
6.3.5 活性碳悬浮液：将3g活性炭,0.5克葡聚糖和0.25克羊单抗血清溶解于1升pH7.45磷酸盐缓冲液(6.3.1)中,混匀.
6.3.5 乙腈/4%氯化钠(1/1, v/v)；由等体积的乙腈与4%氯化钠溶液配制。
7. 仪器设备
7.1 加液器； 0-20 L, 0-1000 L, 0-5000 L
7.2 具塞离心管：10-12mL l,15-20mL,(Schmidt, Germany )
7.3 微量试管 (Eppendort 3812)
7.4 其螺旋盖样品瓶 10-20mL (Beckmann)
7.5 容量瓶 10mL和100mL
7.6 自动加液器,(“Dispensette”,Brand Germany )
7.8 快速真空装置 (savant ,VSA)
7.9 管子搅拌器 型号HEIDOLPH “TOP-mix”
7.10 旋转搅拌器 具有旋转板，型号HEIDOLPH“Reax 2”
7.11 涡旋混合器
7.12 通风橱
7.13 真空离心机( UneEquip,Germany)
7.14 液体闪烁计数器(Beckmann)
7.15 冷冻箱,大约-18℃至-20℃
7.16 冷藏室/冷冻室
7.17 巴氏移液管
7.18 试管 75mm×12mm
7.19 分析天平
7.20 冷冻离心机 (sorvall, USA)
7.21 台式离心机
7.22 C18小柱 (sep-par, C18, Waters-Millipore, Cat No 519)
8. 样本和取样过程
注释：注意事项在ISO文件7812-1982和6.3.1节有所描述。下面注释源于2052/VI/84-EN中的附录Ⅱ.
8.1 样品本性状：牛奶、肉和蛋样品，应是被用来进性行残留物检测的样品。
8.2 样品量：样品量应能满足方法的测定以及重复测定时所需的量。
8.3 取样后的样品必须冷冻，贮存于－20℃以下。