主题：【分享】欧盟兽药检测方法（之三十）

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一道黑

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发表于：2008/12/01 07:29:11 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

气相色谱-质谱法确定胆汁中玉米赤霉醇的残留物（确证法）
Confirmation Of Zeranol In Bile By Gas Chromatography-Mass Spectrometry （EEC， Confirmation Method）

安全操作注意事项及急救
当使用氯化铵时,确保操作系统没有渗漏和通风良好。如果感到不适,离开实验室,呼吸新鲜空气。

引言
玉米赤霉醇（zeranol）是略带雌激素活性的合成雄激素。结构类似于天然雌激素zearalenone。zearalenone是从发霉的玉米黍中分离而得。同其他激素一样，玉米赤霉醇用于家畜的促进生长。

1 主体内容
从1988年1月1日起，欧盟各国禁止动物促生长剂的使用。为了确定农场主没有再使用玉米赤霉醇，在屠宰场通过采集胆汁，用放射免疫法进行筛选，一旦筛选呈阳性，再经气相色谱-质谱法(GC-MS)确认(在英国)。这项工作的贯彻符合欧盟有关残留物的指令（86/469/EEC）。

2 应用范围
在英国，对胆汁中玉米赤霉醇筛选呈阳性时，用本法进一步确认。本法检测限为2 g/L。

3 参考文献
93/256/EEC欧盟决议，拟定的检测激素或甲状腺拮抗素残留物方法[OJ. No. L.118， 14.4.93. PP64-74]。
2052/V2/84文件6.11 II-4，科学兽医委员会，工作组--“残留物参考方法”，残留物测定方法建立通则。
ISO标准78/2-1982标准规划--第二部分：化学分析标准。
GC/MS确认胆汁中玉米赤霉醇的CVL标准操作程序，27th, 1990。

4 定义
玉米赤霉醇含量是指按本法测得的该物质所含玉米赤霉醇的量，不管其化学形式如何。含量以 g/kg或 g/L表达。

5 方法提要
分析方法包括六个步骤
1) 胆汁水解过夜
2) 提取柱净化
3) Double Bond-Elut柱净化
4) 衍生化
5) 柱后衍生净化
6) GC-MS分析
6 试剂
6.1 葡糖苷酶 Boechcinger Bcl （Cat No. 127051）
6.2 二氯甲烷 Fisobs Distol grade (用苯胺稳定化)
6.3 乙醚 Fisons Distol grade
6.4 石油醚 fisons Distol grade(40 - 60℃馏份)
6.5 甲醇 Fisons Distol grade
6.6 七氟丁酸丁酯（HFBA）Phase Sep Ltd （Cat NO. 940851）
6.7 提取柱 Merck BHD
6.8 Bond - Elut柱 500 mg CN, Jones Scientific （Cat NO. 611303）
6.9 Bond.- Elut柱 500 mg NH2, Jones Scientific （Cat No. 611303）
6.10 磷酸缓冲液 pH 7（0.06 mol/L）[3.3 g Na2HPO4 + 5.75 g NaH2PO4,配制成1L]
6.11 磷酸缓冲液 pH 6（1.0 mol/L） [35 g NaH2PO4 + 3 g NaH2PO4,配制成 1L]
6.12 正己烷 Distol grade
6.13 正庚烷 Distol grade
6.14 全氟三丁胺 Fimigar MAT
6.15 标准溶液 Internatwnd Minerals & Chemical Corp
用甲醇配制成1 mg/mL,然后稀释至标准，分别为: 100 g/mL,10 g/mL,1 g/mL,100 ng/mL, 10 ng/mL和1 ng/mL.

7 仪器设备
7.1 试剂瓶 20 mL
7.2 Techni Dri-block
7.3 Quick-fit 管 50 mL (MF-24)
7.4 Quick- fit expansion adaptor (34/35 - 24/29)
7.5 带盖试管 J Bibby (Cat No. 5142 - 10)
7.6 水浴
7.7 Manifold 提供脱氧的氮气
7.8 GC进样瓶和盖子
7.9 质谱计 Finnigan MAT ,与气相联用，INCOS数据系统。

8 样品和取样程序
注意事项在6.3.1节和ISO文件78/2 – 1982中有所描述。下面注释源于 2052/VI/84 - EN的附录II。
8.1 样品属性：样品应符合64/433/EEC指令所规定的测定肉中残留物的要求。生物体液(本法为胆汁)或粪便将构成残留物检测的样品。
8.2 样品量：样品量必需足够满足本法的测试及需要时重复测试的量。对玉米赤霉醇，本法用5 mL胆汁，故样品量不得少于20 mL。
8.3 在实验室取样或包装必须有适当的标签。
8.4 在包装、保存和运输中，必须保持样品的完整性，以免影响测定结果。对于玉米赤霉醇待测样，在保存和运输中温度应低于-18℃。

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2008/12/1 7:29:30 沙发管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

9 测定步骤
9.1 水解
取5 mL胆汁，15 mL磷酸缓冲液(pH7)和50 mL葡糖苷酶于20 mL试剂瓶中, 37℃培养，过夜。
9.2 Extrelut净化
按照使用说明，制备Extrelut柱。该柱放于Quick-fit expansion adaptor中，然后接在50 mL (MF-24) Quick-fit 管端上。加入胆汁缓冲液混合液，停留30分钟，然后用2 35 ml乙酸乙酯洗脱。氮气流下浓缩乙酸乙酯至约5 mL，然后移入10 mL锥形离心管中。氮气流下吹干。加入2 mL二氯甲烷/正己烷（40:60，v/v)溶解残余物。
9.3 Bond-Elut净化
CN键合Bond-Elut柱依次用2 2 ml甲醇和2 2 mL石油醚洗涤。在柱干涸前加入提取液，用2 mL二氯甲烷/正己烷(70:30,v/v)洗涤。NH2键合柱依次用甲醇洗涤二次和2 2 mL石油醚洗涤。用乙酸乙脂饱和NH2柱。CN键合柱接在NH2键柱之上，然后用3 mL乙酸乙酯洗脱。弃去CN键合柱。用2 mL 2% (v/v)甲醇/二氯甲烷洗涤。用3 mL 33% (v/v)甲醇/二氯甲烷洗脱NH2键合柱，洗脱液收集于带盖的离心管中。
9.4 衍生化
吹干甲醇/二氯甲烷提取液，用1 ml 庚烷溶解，加入100 mL HFBA(新开安瓶)，拧紧瓶盖，在Techni Dri-block中，80oC下，3 min后，振摇，保证两相充分混合。20分钟后，移去试管，冷却。
玉米赤霉醇标准浓度 = 1 ng, 10 ng, 50 ng, 100 ng, 500 ng, 1 g, 10 g/mL.
9.5 柱后衍生柱净化
为了改善色谱系统，加入5 mL磷酸缓冲溶液(pH 6)净化衍生提取物。充分振摇30 s，分层(如有必要，在2000 rpm离心5 min)。吸去上层正己烷层，用移液枪设定0.7 mL，立即拧紧进样瓶盖子。
9.6 GC-MS 分析
9.6.1 GC参数
色谱柱：J & W石英毛细管柱，SE-54，15 m 0.25 mm
进样：0.5 L手动进样
温度：(1) 接口：230oC; (2) 进样器：220oC
标液：
-------------------------------------------------------
初始浓度最终浓度速率时间总时间
(℃) (℃) (℃/min) (min) (min)
-------------------------------------------------------
55 55 1.0 1.0
55 240 20 9.2 10.2
240 240 10.0 20.2
-------------------------------------------------------
载气：氦
流速 = 1 cm3/min
进样压力 = 10 psi
GC阀：毛细管关闭：0.00 打开：0.7
分流关闭：0.00 打开：20.2
9.6.2 按下面设定MS参数。用适当校正剂(例如PFTBA调整剂)进行校正。
离子化源模式：化学离子化(CI)
温度：130℃
压力：50 Torr
多支管：
温度：90( 5)℃
电子倍增器：1.2 kV
电子能量：70 eV
反应气：氨
其它参数通过校正仪器达到最佳化，具体操作参考仪器说明书。
9.6.3 化学离子化模式中，用氨作为反应气，在m/z = 50 - 700 之间扫描。
(a) 空白正己烷
(b) 100 L溶液中含10 g玉米赤霉醇标准品，采集1000扫描。
9.6.4 对玉米赤霉醇标准品聚焦。在谱图中找出离子279，296，519和526的精确质量。
9.6.5 用这些质量设定或调整多离子检测(MID)扫描目录，建立扫描目录。
9.6.6 注入正己烷, 确定没有载入玉米赤霉醇。
9.6.7 用建立的扫描目录，对标准品和样品进行GC-MS分析，可采取：
(a) 首先分析100 g标准品，确保MID设定准确，随后注入正己烷。
(b) 以浓度递增的序列分析标准品
(c) 在组分流出色谱柱进入离子源之前，打开灯丝，100扫描后关闭。
(d) 每次进样之间，注入正己烷。

10 结果计算
如果GC-MS数据符合下面的标准，确定样品中有玉米赤霉醇
1.在GC中，出峰时间与标准品一致。
2.扣除背景后，所选择的离子在质谱图中都出现。
3.所选择的离子比与标准品相一致。
如果样品中有玉米赤霉醇，并符合上面标准，定量计算按下面二种方法选择其一：
1.用数据系统计算峰面积，建立定量表，用相应标准品或用标准品系列建立定量数据库。以样品数据对照该数据库，得出定量报告。本法为首选方法。
2.测定样品和相关标准品的峰面积。玉米赤霉醇在待测总样品中浓度由下式计算：

样品峰高
------------ 标准品浓度
标准峰高
检测限：2 g/L 胆汁。
用于trenbolone(参考trenbolone 标准操作程序)的TMS衍生同样适用于玉米赤霉醇。这样质谱仪采用EI模式，离子聚焦于307，335，433，538。

11 特殊事例

12 方法注意点

13 质量控制，标准品和参考物质
玉米赤霉醇参考物质制备参阅 Measuremt and Testing Programse of DG12

14 检测报告

15 缩略语（略）

16 检验流程图

酶解酯洗脱
胆汁-------→ extrelut柱---------→ 吹干--→ CH2Cl2/MeOH----→ CN-Bond-Elut柱

洗脱洗脱
-------→ NH2-Bond-Elut柱 -------→ CH2Cl2/MeOH --→ HFBA衍生 -----→ 用磷酸

缓冲液净化 -----→ GC-MS ---------→ 计算结果。

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