主题：【哺育新手活动】梯度鬼峰分析

HPLC仪器梯度鬼峰故障分析
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摘要：Abstract
HPLC梯度洗脱，水相或有机相中的强保留杂质在开始洗脱时，由于有机相的比例低，在柱子上保留而不被洗脱，但当流动相中有机相比例不断加大，在色谱柱中吸附浓缩的杂质开始被洗脱，从而在某些位置出现异常峰（鬼峰）。
关键词 Key words
梯度洗脱  鬼峰  HPLC
综述：Summarize
在流动相中存在有紫外吸收的杂质，梯度洗脱能够将杂质分离出来，即使在不进样的情况下，空白分析也会出峰。在等度洗脱的情况下，流动相的少量杂质一般不会影响基线和噪音，这些杂质要么不出来，要么不间断出来，不会产生异常峰（鬼峰）。本文就实验室HPLC梯度分析出现鬼峰的问题进行分析，讨论产生的原因及存在的问题。
1 故障描述
1.1 仪器与设备
仪  器：J01LC010（shimadzu CLASS-VP）
色谱柱：NuckesiL 100-5 C18 HD 125mm*4.6mm*5um
柱  温：50℃
流动相 A： 1L水中加入2mL 85%的磷酸  B：乙腈
1.2 故障描述
1.2.1走空白梯度14.2min出现异常峰，峰高54551uV,峰面积333642左右。如图所示：
表一、梯度参数设置表（1）
                                                                                                                                                                                                     
    参数设计条件为原分析方法，未进样、未扳进样阀（LOAD状态）运行的空白谱图，13.6min有一未知峰，如图一所示。由于未进样和LOAD状态，出现杂峰初步判断可能是仪器、色谱柱污染或者流动相污染。



图一、参数（1）谱图

1.2.2 等度条件，无基线平稳，无异常峰
等度条件  乙腈：水 = 85 ：15 ，噪音：        漂移：
图二、等度条件谱图

等度条件下（有机相85%），没有洗脱出任何杂质
1.2.3 梯度条件（2）
表二、梯度参数设置表（2）
参数1梯度条件出峰，而等度洗脱却无异常峰，改变梯度条件，如表二所示，考察异常峰的出峰状况。梯度时间缩短，异常峰依旧出现，且出峰时间提前，如图三所示，8.8min.





图三、参数二谱图

1.2.4 梯度条件（3）
从上述谱图的发现，该异常峰在梯度条件下才会洗脱出来，而在等度下不能洗脱，设置梯度条件（3），确认这一现象。
表三 梯度参数设置表（3）
时间min    B组分%    时间min    B组分%    时间min    B组分%
0.01    20    15    20    30    20
5    85    20    85    35    85
15    85    25    85    45    85
12    20    27    20    47    20

图四、参数（3）谱图

从谱图上可以看出，不断的重复梯度条件，在B组分接近最高时出现异常峰。
1.3 运行J01LC004（shimadzu CLASS-VP）同样出现以上的状况。
2、故障分析及排除
梯度条件下出现异常峰，而等度没有，主要的原因有：
A、流动相含有有紫外吸收的杂质（包括色谱用水、有机溶剂、试剂等）
溶剂的纯度不高会导致重现性差，基线不稳等，在梯度洗脱过程中，开始溶剂极性较弱，杂质不能被洗脱，而是在柱头富集，当溶剂极性增强时，杂质被洗脱，故在梯度条件下极性强时出现鬼峰；在等度条件下，有两中情况，一是不出鬼峰，有紫外吸收的杂质量不足以被检测出来，及低于检测限，二是不间断的出鬼峰，此时有紫外吸收的杂质量是大于检测限的。
B、梯度条件不适当
梯度条件变化速率太快会导致梯度出现鬼峰
C、比例阀和实验室温度
比例阀故障，两相混合出现气泡导致出现鬼峰，实验室温度超过检测器使用温度，检测器易形成气泡，导致鬼峰。
2.1 所用试剂分析
流动相中所用试剂为
A、磷酸（85%）
B、乙腈
C、色谱用水
2.1.1 磷酸
由于磷酸以往出现过污染导致出鬼峰的案例，故首先调查磷酸。
图为85%的磷酸紫外吸收图：

原使用磷酸：批号：              来源：                  有效期：
更换后磷酸：批号：              来源：                  有效期：
从紫外吸收图明显可以看出，225nm处，原磷酸有吸收，该批磷酸污染，需更换。
对系统进行清洗，更换为新的磷酸，鬼峰依旧出现，故磷酸只是鬼峰的原因之一。
2.1.2 乙腈
乙腈 批号：              来源：            COA：
更换一瓶同批次的乙腈，鬼峰无任何改善。

3、结论 Conclusion

一般走空白梯度是不进样的，大多数情况这些异常峰是流动相本身造成的。在等度洗脱的情况下，流动相的少量杂质一般不会影响基线和噪音，这些杂质要么不出来，要么不间断出来，不会产生异常峰（鬼峰）。
还有，如果梯度设置不当，流动相比例变化太快，紫外波长较低时也容易出现异常峰。另外需要注意的是，如果梯度泵的比例阀有问题或流动相混合器效果不好或有少量的气泡存在，也会出现这种现象。


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参考文献
吴方迪，色谱仪器维护与故障排除，北京：化学工业出版社，2001.5，204～209

自己跟帖以下，没人回啊！

我都提醒了你，整理下，那样才直观

写的很详细,你的图片没有上传上来,重新上传一下吧

不错 写得很详细

谢谢分享……………………

如果有图的话就更好了！

学习了。谢楼主

梯度洗脱中，鬼峰问题是一个非常复杂和难以解决的问题，我用过一个方法，出现过非常稳定的干扰峰——Merk纯水（德国货）、Merk（德国货），Agilent1260（新仪器，刚开始运行），新的色谱柱，其干扰峰的情况和旧柱子一模一样，都快要疯了！

看看呢。。。