主题：【讨论】为何会出双峰？

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发表于：2010/01/04 09:04:38 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

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我们最近做一个亚氨基化合物的分析（马来酸酐和一个伯胺形成的一个亚胺化合物），用的70/30（甲醇/水）的流动相，其中的水相用硼酸调pH 5-6，但跑出来的峰形却很怪，居然是双峰，两个峰的高度也不一定，有时一样高，有时不一样高，各种比例都有（见后图），不管是我们自己做出来的产品还是客户提供的合格产品（相当于标样），跑出来都是这个样子，搞不懂是什么原因，希望各位高手能够分析分析原因，讨论讨论

同意后面tyys98的观点，很可能是缓冲液的缓冲容量不足，导致一部分产品转化成了季铵盐，而另一部分没有转化，所有在柱子里面就出来两个峰。因为我们在做的过程中也发现一个现象，就是用流动相溶解样品的时候，在进第一针的时候，第一个峰很小，第二个峰很大，再进第二针的时候，两个峰就差不多一样大了，再进第三针的时候，第一个峰就变得比第二个峰大了

产品结构

产品液相图

推荐答案：tyys98回复于2010/01/06

我觉得有两种可能，要么是样品不稳定产生异构，要么是流动相的酸性使部分样品酸化成了季铵盐，个人认为后一种的可能性更大一些，因为感觉这个样品还是蛮稳定的，产生异构的可能性不大

后来我们用甲醇直接稀释后直接进样就只有一个峰了，现在唯一担心的就是，用甲醇做稀释剂会不会因为甲醇与流动相（甲醇：水=70：30）的极性差异而产生溶剂效应，因为原来在用流动相溶解跟踪样的时候，会产生分层现象（跟踪样的反应体系是甲苯溶剂体系），用甲醇溶解，不会产生分层现象

现在做下来的结果，大概似乎好像maybe可能是用甲醇的结果要稍微好一些，因为甲醇把双峰变成了单峰，而且消除了分层现象，至于进到柱子里面以后甲苯还会不会与水分层，那个，我看不见，估计应该影响不大，因为做产品没有什么大的影响，做跟踪有丁点影响也看不出来，原来的跟踪样本来就经常出些乱七八糟的不规则的大包，梯形、馒头形，从头拉到尾的那种，积分的时候根本都不看的那种
首先排除色谱柱的问题，因为可以看到后边7分、15分的两个杂质峰形正常。
第二，根据你的这些叙述，我的猜测是流动相不太合适，具体来说是缓冲液的pH值以及缓冲容量不合适，再具体一点，是pH值过低或缓冲容量不足（相对于进样量而言）。因为这种化合物在酸性条件有可能质子化，生成季铵盐或者进一步重排为芳香醇结构？最大可能是注进的样品在管道中酸性流动相中部分转化为季铵盐，由于缓冲容量不足另一部分仍为原结构，进样后在后续流动相作用下逐渐转化为季铵盐形式形成后边的峰，两者峰面积会随每次进样条件的细微差异产生微妙的变化。
解决方法：
1）在更强的酸性条件下分离
2）适当增加缓冲容量
3）用流动相配制（稀释）样品工作液（浓度更高的贮备液可依旧）。
如果以上方案有效，就可以证实我的推测。从仪器保养的角度，不提倡使用高浓度的缓冲盐，所以第3点格外重要。