概述：本专题报告简单阐释了高效液相色谱的优缺点、分类及其特点，阐释了目前高效液相色谱法的特点，归纳总结了建立高效反相色谱（检外检测器）检测方法的几条建议。

1 高效液相色谱的优缺点

检测的分辨率和灵敏度高，分析速度快，重复性好，定量精度高，应用范围广。适用于分析高沸点、大分子、强极性、热稳定性差的化合物。其缺点是：价格昂贵，要用各种填料柱，容量小，分析生物大分子和无机离子困难，流动相消耗大且有毒性的居多。目前的发展趋势是向生物化学和药物分析及制备型倾斜。

2 高效液相色谱法的分类及其特点

高效液相色谱法按分离机制的不同分为液固吸附色谱法、液液分配色谱法（正相与反相）、离子交换色谱法、离子对色谱法及分子排阻色谱法。

反相色谱法：一般用非极性固定相（如C18、C8）；流动相为水或缓冲液，常加入甲醇、乙腈、异丙醇、丙酮、四氢呋喃等与水互溶的有机溶剂以调节保留时间。适用于分离非极性和极性较弱的化合物。反相色谱法在现代液相色谱中应用最为广泛，据统计，它占整个HPLC应用的80%左右。随着柱填料的快速发展，反相色谱法的应用范围逐渐扩大，现已应用于某些无机样品或易解离样品的分析。为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的pH值。但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常为2.5～7.5（2～8），太高的pH值会使硅胶溶解，太低的pH值会使键合的烷基脱落。有的新商品柱可在pH 1.5～10范围操作。

离子对色谱法：又称偶离子色谱法，是液液色谱法的分支。它是根据被测组分离子与离子对试剂离子形成中性的离子对化合物后，在非极性固定相中溶解度增大，从而使其分离效果改善。主要用于分析离子强度大的酸碱物质。分析碱性物质常用的离子对试剂为烷基磺酸盐，如戊烷磺酸钠、辛烷磺酸钠等。另外高氯酸、三氟乙酸也可与多种碱性样品形成很强的离子对。分析酸性物质常用四丁基季铵盐，如四丁基溴化铵、四丁基铵磷酸盐。离子对色谱法常用ODS柱（即C18），流动相为甲醇-水或乙腈-水，水中加入3～10 mmol/L的离子对试剂，在一定的pH值范围内进行分离。被测组分保时间与离子对性质、浓度、流动相组成及其pH值、离子强度有关。例如强酸或强碱，其在反相键合相上的保留值很低，近于死时间流出，不能进行分析。根据离子对色谱的原理将一种与样品离子电荷（A＋）相反的离子（B－），称为对离子，加入到流动相中，使其与样品离子结合生成弱极性的离子对，即中性缔合物，从而增强了样品的疏水性，加大了保留值，改善了分离效果。

分子排阻色谱法：固定相是有一定孔径的多孔性填料，流动相是可以溶解样品的溶剂。小分子量的化合物可以进入孔中，滞留时间长；大分子量的化合物不能进入孔中，直接随流动相流出。它利用分子筛对分子量大小不同的各组分排阻能力的差异而完成分离。常用于分离高分子化合物，如组织提取物、多肽、蛋白质、核酸、明胶等。

3 目前检测用高效液相色谱法的特点

原材料检测目前主要涉及反相色谱，反相色谱固定相为非极性，流动相为极性。重要的键合相是硅烷化键合相，它是硅胶与有机硅烷反应的产物。最常用的键合相键型是： —Si—O—Si—C。最常用的“万能柱”填料为“C18”，简称“ODS”柱，即十八烷基硅烷键合硅胶填料（Octadecylsilyl，简称ODS）。这种填料在反相色谱中发挥着极为重要的作用，它可完成高效液相色谱70～80％的分析任务。由于C18(ODS)是长链烷基键合相，有较高的碳含量和更好的疏水性，有更强的适应能力，因此在化学分析工作中应用的最为广泛，近年来，为适应氨基酸、小肽等生物分子的分析任务，又发展了CH、C3、C4等短链烷基键合相和大孔硅胶（20～40μm）。

反相色谱最常用的流动相及其冲洗强度如下：H2O＜甲醇＜乙腈＜乙醇＜丙醇＜异丙醇＜四氢呋喃

最常用的流动相组成是：“甲醇—H2O”和“乙腈—H2O”，由于乙腈的毒性较强，通常优先考虑“甲醇—H2O”流动相。反相色谱中，如果要在相同的时间内分离同一组样品，甲醇/水作为冲洗剂时其冲洗强度配比与乙腈/水或四氢呋喃/水的冲洗强度配比有如下比例关系： 100%甲醇的冲洗强度相当于89%的乙腈/水或66%的四氢呋喃/水的冲洗强度。

反相色谱中，溶质按其疏水性大小进行分离，极性越大疏水性越小的溶质，越不易与非极性的固定相结合，所以先被洗脱下来。流动相的pH对样品溶质的电离状态影响很大，进而影响其疏水性，采用反相色谱法分离弱酸（3≤pKa≤7）或弱碱（7≤pKa≤8）样品时，通过调节流动相的pH值，以抑制样品组分的解离，增加组分在固定相上的保留，并改善峰形的技术称为反相离子抑制技术。对于弱酸，流动相的pH值越小，组分的k值越大，当pH值远远小于弱酸的pKa值时，弱酸主要以分子形式存在；对弱碱，情况相反。分析弱酸样品时，通常在流动相中加入少量弱酸，常用50mmol/L磷酸盐缓冲液和1%醋酸溶液；分析弱碱样品时，通常在流动相中加入少量弱碱，常用50mmol/L磷酸盐缓冲液和30mmol/L三乙胺溶液。流动相中加入有机胺可以减弱碱性溶质与残余硅醇基的强相互作用，减轻或消除峰拖尾现象。所以在这种情况下有机胺（如三乙胺）又称为减尾剂或除尾剂。

4 建立反相色谱（检外检测器）检测方法的建议

① 检测波长要大于溶剂截止波长。如果所选择的波长下溶剂有很强的吸收当然是不合适的。溶剂有强吸收后，基线抬高，减小检测的线性范围而且会加大基线噪声，对溶质的检测灵敏度下降。

② 对各组分都要有适当的吸收。一般是不可能做到的。所以只要选择一个对大多数组分都有较大吸收的波长就可以了。

③ 外标法定量时，要选择被测组份最大吸收波长。

④ 254nm 对常见的共轭结构和羰基官能团都有吸收。对饱和基团也有弱的吸收。而对于常见的乙腈、甲醇的透过率很高。是在不知道用什么波长时最理想的试验波长。

⑤ 流动相冲洗强度由强到弱：一般先用90%的乙腈(或甲醇)/水(或缓冲溶液)进行试验，这样可以很快地得到分离结果，然后根据出峰情况调整有机溶剂(乙腈或甲醇)的比例。

⑥ 三倍规则：每减少10%的有机溶剂(甲醇或乙腈)的量，保留因子约增加3倍，此为三倍规则。这是一个聪明而又省力的办法。调整的过程中，注意观察各个峰的分离情况。

⑦ 粗调转微调：当分离达到一定程度，应将有机溶剂10%的改变量调整为5%，并据此规则逐渐降低调整率，直至各组分的分离情况不再改变。

附件：

高效液相色谱技术小结(1).doc

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