8 定量测定
8. 1 标准曲线制备 基于对照品色谱的稳定性、精密度、重复性和保留时间变化的考察,制得6种苷的标准曲线。
8. 2 样品测定 假定当药黄素与异当药黄素紫外响应值相似,以上述色谱条件测定了10批样品及1批不同工艺生产所得样品( Sample I) 和药材( Sample II)中7种苷的含量,结果表明10批样品中每种苷的含量差别不大, 但明显与Sample I和Sample II不同; Sample II中1-7的含量均低于总苷提取物中1- 7的含量;而Sample I中1和2的含量明显低于总苷提取物中1和2的含量,而3-7含量几无差别。由此可见,通过该指纹图谱及相应7种苷的含量测定可以监控总苷提取工艺,同时控制产品质量。
讨论
在相同色谱条件下测定獐牙菜药材的HPLC图谱,并与总苷的含量及色谱图比较,发现两者有很好的相关性。獐牙菜总苷的指纹图谱中主要特征峰1-9等均可在药材中找到相应的峰,而且总苷经过提取纯化,杂质少,相对含量较高。同时,也说明指纹图谱必须结合含量测定才能全面控制植物提取物的质量。
在相同色谱条件下测定一种不同工艺生产的提取物的HPLC图谱,并与总苷的含量及色谱图比较,发现,除了有很好的相关性外,其1和2的相对含量是明显不同的,由此得到提示,指纹图谱结合含量测定,可以监控生产工艺过程。
液相色谱-质谱联用技术(LC/MS)是20世纪90年代成熟起来的一项新技术,具有灵敏度高、选择性强、分离和结构确证一次完成等特点,结合现代LC/MS一技术可以全面、准确、可信地制定产品的标准指纹图谱。
本实验曾选用Waters Nova-Pak C18( 3.9mm×150 mm,5μm) ,采用各种洗脱方式分别进行了色谱条件的考察,结果表明,本文的实验条件可以满足分析要求。等度洗脱测定时分离效果较差,如以梯度洗脱法则在35min内可使大部分色谱峰得到基线分离。实验表明,以梯度洗脱程序运行32min,然后以终浓度等度洗脱运行到42min后回到起始浓度。可基本除去残留样品,不影响下次分离。另外,每次运行后柱平衡时间至少需要15min,才能确保下次分析时色谱峰的峰形及分离度。以上含量测定和图谱比较(相对峰面积、相对保留时间)结果说明:在抱茎獐牙菜提取物的指纹图谱具备相似性的情况下,必须对其中的有效指标成分进行定量,这样才能全面地反映出复杂成分混和物的整体质量,单一指标则很难反映其内在的质量。采用该法可以在一个色谱条件下同时实现整体定性、多指标成分定量的功能,用于质量控制。该法也可以用于药材及本属植物的质量控制。