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凝胶色谱（GPC）

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主题：【第三届网络原创参赛作品】液相色谱之玩法—普通液相色谱改成凝胶色谱实录

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2010/7/2 5:20:21 Last edit by yaofei

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2010/7/2 5:19:33 12楼管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

5．一些问题
作了一段时间的GPC，感觉它无论理念和习惯是和液相色谱定量分析大不相同。是由于没能接触到GPC的专业人员，遇到很多问题和困惑找不到可以讨论的人，在论坛中也很少有人提到。前不久花了1000元去上了安捷伦一天的GPC培训，可能我的要求太高，觉得基本就在讲软件操作，而这个只要是GPC操作人员就知道怎么做，而我有些问题的回答让我不太满意。后来在反馈意见上说希望增加实际操作中的问题及解决方案，也许以后能有所提高吧。
这里我列举一些我遇到问题和我认为的答案，希望能得到相关专家的批评和指正。

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2010/7/2 5:21:21 13楼管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

5.1 浓度问题
在培训的时候我问过培训老师，样品的含量重要吗，她说当然，计算不同分子量时要用到。也许是她没理解我的意思，我知道在计算分子量公式是有物质的量的数据的。但我想问的是在GPC分析时，样品的浓度误差对最终分析的结果影响到底多大？
这其实分为2个方面，一个是样品的浓度，做一般液相分析时分析天平、容量瓶、准确的手势是实验准确性的保证，但是在GPC测定时，即使做的再正确，你会发现根本没有地方需要运用你的浓度数据进行计算。由于GPC测的分子量分布，不管浓度高低，分子段的比例是不变的。因此我有以下结论：
a．样品浓度的准确性要求并不高：我是在样品瓶中加入几粒样品然后用溶剂加到瓶子上的刻度。
b．样品浓度应该根据柱子容量、灵敏度等选择（有人还说根据分子量大小调整，分子量小的浓度高些，我暂时还没有分子量相差较大的样品来比较）：我的柱子建议浓度0.05-0.5%，因为这个样品在目前体系上灵敏度不高，我用到了近上限0.4%。
c．为了较好的重复性，最好浓度比较接近：按目前我的做法，浓度基本上0.35-0.45%，比起一般液相色谱当然不够精密，不过基本也保持在上限。

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2010/7/2 5:23:19 14楼管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

另一个问题就是我现在仍然比较困惑的问题，就是各分子量浓度（或者说各分子量相对比例），这个主要表现在标样上，一组混标当然没问题，证书上会有各分子量的比例，不管配置浓度是否准确，比例是不会变的。但是我用的是2组混标10个分子量，每组是一个小棒子上沾了一点聚苯乙烯标样，按照说明溶到2ml溶剂中，在校正表的重量一栏我都用的默认的1，但是我称过溶解前后棒子质量，发现溶解掉的聚苯乙烯并不一样，而且溶剂是挥发性的，也不能保证2ml的准确性，这样10个做到一个图里，浓度比例应该不一样的。如果在计算分子量的时候用的这个分子的量是按照标样浓度与响应值来算的，显然会造成误差。为了证实一下我的想法，我尝试把表中某些分子量的比例从1改到3（从浓度来说是相当大的变化了）,标线是分子量对应流出体积，本来不该有变化，但事实有变化（尽管不明显），但用于最后的分子量分布结果变化很小。
我想软件中既然有用到浓度比例的，应该有用的，不清楚其如何计算，就无法判断它对误差的影响程度，如果我验证方法是正确的，那么分子量浓度比例差异引起得误差可以忽略不计，但这个结论还要与大家共同探讨。

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2010/7/2 5:24:35 Last edit by yaofei

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2010/7/2 5:27:45 15楼管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

5.2 重复性问题

做分析方法的必须考虑的就是准确性、精密度，我在做GPC之前之后问过很多人什么样的误差是合理的，答案有5%、10%、20%（这个好像有点吓人了），如果上述答案都是有依据的话，我觉得答案的前提可能跟分子量范围和测试条件有关，但回答的人都忘了前提了。我问课题组的重均分子量在10万左右的，我出的数据变动多少认为正常，他们说差几千是正常的。我连续做了重复测定了几次，发现分子量也就差个1、2千，而同一张图，我对图的积分时间稍做变化（两端都在基线上），统计分子量能差3千多。从我的测定结果看重复性是很好的，误差比数据处理的误差还小，似乎做平行都没什么意义了。

因此我觉得：

a．在评价结果重复性时应该使用峰位分子量而不是统计的平均分子量，因为统计分子量的数据还多了一项数据处理这一人为因素影响的不确定性。

b．同一系统下测定分子量的误差主要是保留时间的变动，应该是和体系稳定性有较大关系。体系变动引起的保留时间变动是有一定范围的，因此如果适合样品分子量测定的色谱柱分子量范围越窄其变动同样保留时间引起的分子量变动的绝对值也越小。因此对测定通用性和精密度这对矛盾的不同侧重决定了色谱柱型号的选择。

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2010/7/2 5:28:18 16楼管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

5.3 标定周期问题
相比一般液相色谱，GPC标样很贵。上面说过我买的是一次性标样可以用10次，要是每次做样都标定，很快就没了。所以当初打算用完一次性的以后，再买国产单标自己配。咨询做GPC的同行，没有一个准确说法，不过我遇到的都不是每次做标定的。有的说一月一次，有的说觉得有问题再标定，还有一个夸张到装机时标定过一次以后就没再标定，也不清楚到底是重复性好不需要经常标定，还是因为标样价格贵舍不得标定。
基于如此，我本来打算将一份样品留下来作为质控标样，当分子量相差太多时才做标定，相差范围暂定±5%。现在发现我的样品可能随着时间长会有所降解，因此还是想有机会买一瓶国产的聚苯乙烯单标做为质控样比较好。

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2010/7/2 5:29:18 17楼管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

5.4 谱图最后的负峰

我的图最后有3个负峰，比分子量最小的峰（分子量几百）还要晚，资料中色谱图也有这样的峰。培训老师说是溶剂的原因，边上的同行引用资料的说明说第一个大的负峰是溶剂中的稳定剂，后面是压力降。我觉得并不对，因为稳定剂分子量不会比溶剂低，应该在溶剂峰之前，我用的是氯仿跟四氢呋喃不同，不需要稳定剂。还有我不知道压力降引起负峰是折光检测器的特征还是GPC的特征，这就待以后我GPC用紫外检测器或普通液相色谱体系用折光检测器来验证了，如果谁做过这方面工作或对此有见地，请指教。

氯仿的谱图