主题：【分享】高效液相色谱知识普及

九、液相色谱柱的维护
1、 注意正确地使用和存放色谱柱，不锈钢柱色谱柱可选用以下的溶剂保存：
正相柱用烃类溶剂，反相柱用甲醇，离子交换柱用水或甲醇/水。某些专用
分析色谱柱要注意制造商规定的保存条件。另外，要注意溶液的PH值，一
般控制在PH2－8范围内，其硅胶柱PH＞8时会发生硅胶溶脱的情况，键合
型柱PH＜2时会发生键合相断裂。
2、 色谱柱污染后可采用合适的溶剂冲洗，使柱效再生。
a、硅胶柱可以使用正庚烷、氯仿、乙酸乙酯、丙酮、乙醇和水按顺序冲洗色谱柱，经过净化的色谱柱必须进行水活化，即按上述相反的顺序冲洗。柱再生时所需要的有机溶剂要严格进行脱水处理。
b、反相柱可以用甲醇、氯仿、正庚烷冲洗，键合C18柱一般用甲醇冲洗，必要时可用0.5 M EDTA钠盐溶液冲洗，然后用水冲洗，以达到去除柱内盐类。
c、键合型的离子交换柱可以用缓冲溶液、水、甲醇冲洗。
3、 对污染严重的色谱柱在冲洗无效时，需将柱内填料取出进行处理或更换新的填料，还可以用更换柱头填料的方法即将柱头入口处的被污染的填料取出，重新补装和柱内同类型的填料，然后在改变柱流向进行再生。这种逆流再生柱的方法，可以救活大部分柱子。
4、入色谱柱的溶剂、标液、样品溶液都必须严格过滤，以去除杂质，防止堵塞色谱柱。当用反冲洗方法无效时，可将柱口过滤装置取下，用弱酸溶液处理，去除污物或定期更换。
5、 建议：为了保护色谱柱，避免给分析带来不必要的麻烦，请使用保护柱！！
液相色谱仪由高压液体泵、检测器及液相色谱柱等三部分组成，其中液相色
谱柱的正确安装和使用，是液相色谱工作的关键；也是液相色谱工作者获得
正确可靠的实验数据的必经之路。

十、流动相
1．流动相的性质要求
一个理想的液相色谱流动相溶剂应具有低粘度、与检测器兼容性好、易于得到纯品和低毒性等特征。
选好填料（固定相）后，强溶剂使溶质在填料表面的吸附减少，相应的容量因子k降低；而较弱的溶剂使溶质在填料表面吸附增加，相应的容量因子k升高。因此，k值是流动相组成的函数。塔板数N一般与流动相的粘度成反比。所以选择流动相时应考虑以下几个方面：
a.流动相应不改变填料的任何性质。低交联度的离子交换树脂和排阻色谱填料有时遇到某些有机相会溶胀或收缩，从而改变色谱柱填床的性质。碱性流动相不能用于硅胶柱系统。酸性流动相不能用于氧化铝、氧化镁等吸附剂的柱系统。
b.纯度。色谱柱的寿命与大量流动相通过有关，特别是当溶剂所含杂质在柱上积累时。
c.必须与检测器匹配。使用UV检测器时，所用流动相在检测波长下应没有吸收，或吸收很小。当使用示差折光检测器时，应选择折光系数与样品差别较大的溶剂作流动相，以提高灵敏度。
.粘度要低（应<2cp）。高粘度溶剂会影响溶质的扩散、传质，降低柱效，还会使柱压降增加，使分离时间延长。最好选择沸点在100℃以下的流动相。
e对样品的溶解度要适宜。如果溶解度欠佳，样品会在柱头沉淀，不但影响了纯化分离，且会使柱子恶化。
f样品易于回收。应选用挥发性溶剂。
2．流动相的选择
在化学键合相色谱法中，溶剂的洗脱能力直接与它的极性相关。在正相色谱中，溶剂的强度随极性的增强而增加；在反相色谱中，溶剂的强度随极性的增强而减弱。正相色谱的流动相通常采用烷烃加适量极性调整剂。反相色谱的流动相通常以水作基础溶剂，再加入一定量的能与水互溶的极性调整剂，如甲醇、乙腈、四氢呋喃等。极性调整剂的性质及其所占比例对溶质的保留值和分离选择性有显著影响。一般情况下，甲醇-水系统已能满足多数样品的分离要求，且流动相粘度小、价格低，是反相色谱最常用的流动相。推荐采用乙腈-水系统做初始实验，因为与甲醇相比，乙腈的溶剂强度较高且粘度较小，并可满足在紫外185~205nm处检测的要求，因此，综合来看，乙腈-水系统要优于甲醇-水系统。在分牒圆畋鸾洗蟮亩嘧榉盅肥保耸垢髯榉志泻鲜实膋值并分离良好，也需采用梯度洗脱技术。乙腈的毒性是甲醇的5倍，是乙醇的25倍。价格是甲醇的6~7倍。反相色谱中，如果要在相同的时间内分离同一组样品，甲醇/水作为冲洗剂时其冲洗强度配比与乙腈/水或四氢呋喃/水的冲洗强度配比有如下关系：
C乙腈＝0.32C 2甲醇＋0.57C甲醇
C四氢呋喃＝0.66C甲醇
C为不同有机溶剂与水混合的体积百分含量。100%甲醇的冲洗强度相当于89%的乙腈/水或66%的四氢呋喃/水的冲洗强度。
3．流动相的pH值
采用反相色谱法分离弱酸（3≤pKa≤7）或弱碱（7≤pKa≤8）样品时，通过调节流动相的pH值，以抑制样品组分的解离，增加组分在固定相上的保留，并改善峰形的技术称为反相离子抑制技术。对于弱酸，流动相的pH值越小，组分的k值越大，当pH值远远小于弱酸的pKa值时，弱酸主要以分子形式存在；对弱碱，情况相反。分析弱酸样品时，通常在流动相中加入少量弱酸，常用50mmol/L磷酸盐缓冲液和1%醋酸溶液；分析弱碱样品时，通常在流动相中加入少量弱碱，常用50mmol/L磷酸盐缓冲液和30mmol/L三乙胺溶液。
注：流动相中加入有机胺可以减弱碱性溶质与残余硅醇基的强相互作用，减轻或消除峰拖尾现象。所以在这种情况下有机胺（如三乙胺）又称为减尾剂或除尾剂。
4．流动相的脱气
HPLC所用流动相必须预先脱气，否则容易在系统内逸出气泡，影响泵的工作。气泡还会影响柱的分离效率，影响检测器的灵敏度、基线稳定性，甚至使无法检测。（噪声增大，基线不稳，突然跳动）。此外，溶解在流动相中的氧还可能与样品、流动相甚至固定相（如烷基胺）反应。溶解气体还会引起溶剂pH的变化，对分离或分析结果带来误差。
溶解氧能与某些溶剂（如甲醇、四氢呋喃）形成有紫外吸收的络合物，此络合物会提高背景吸收（特别是在260nm以下），并导致检测灵敏度的轻微降低，但更重要的是，会在梯度淋洗时造成基线漂移或形成鬼峰（假峰）。在荧光检测中，溶解氧在一定条件下还会引起淬灭现象，特别是对芳香烃、脂肪醛、酮等。在某些情况下，荧光响应可降低达95%。在电化学检测中（特别是还原电化学法），氧的影响更大。
除去流动相中的溶解氧将大大提高UV检测器的性能，也将改善在一些荧光检测应用中的灵敏度。常用的脱气方法有：加热煮沸、抽真空、超声、吹氦等。对混合溶剂，若采用抽气或煮沸法，则需要考虑低沸点溶剂挥发造成的组成变化。超声脱气比较好，10~20分钟的超声处理对许多有机溶剂或有机溶剂/水混合液的脱气是足够了（一般500ml溶液需超声20~30min方可），此法不影响溶剂组成。超声时应注意避免溶剂瓶与超声槽底部或壁接触，以免玻璃瓶破裂，容器内液面不要高出水面太多。
离线（系统外）脱气法不能维持溶剂的脱气状态，在你停止脱气后，气体立即开始回到溶剂中。在1~4小时内，溶剂又将被环境气体所饱和。
在线（系统内）脱气法无此缺点。最常用的在线脱气法为鼓泡，即在色谱操作前和进行时，将惰性气体喷入溶剂中。严格来说，此方法不能将溶剂脱气，它只是用一种低溶解度的惰性气体（通常是氦）将空气替换出来。此外还有在线脱气机。
一般说来有机溶剂中的气体易脱除，而水溶液中的气体较顽固。在溶液中吹氦是相当有效的脱气方法，这种连续脱气法在电化学检测时经常使用。但氦气昂贵，难于普及。
5．流动相的滤过
所有溶剂使用前都必须经0.45um（或0.22um）滤过，以除去杂质微粒，色谱纯试剂也不例外（除非在标签上标明“已滤过”）。
用滤膜过滤时，特别要注意分清有机相（脂溶性）滤膜和水相（水溶性）滤膜。有机相滤膜一般用于过滤有机溶剂，过滤水溶液时流速低或滤不动。水相滤膜只能用于过滤水溶液，严禁用于有机溶剂，否则滤膜会被溶解！溶有滤膜的溶剂不得用于HPLC。对于混合流动相，可在混合前分别滤过，如需混合后滤过，首选有机相滤膜。现在已有混合型滤膜出售。
6．流动相的贮存
流动相一般贮存于玻璃、聚四氟乙烯或不锈钢容器内，不能贮存在塑料容器中。因许多有机溶剂如甲醇、乙酸等可浸出塑料表面的增塑剂，导致溶剂受污染。这种被污染的溶剂如用于HPLC系统，可能造成柱效降低。贮存容器一定要盖严，防止溶剂挥发引起组成变化，也防止氧和二氧化碳溶入流动相。
磷酸盐、乙酸盐缓冲液很易长霉，应尽量新鲜配制使用，不要贮存。如确需贮存，可在冰箱内冷藏，并在3天内使用，用前应重新滤过。容器应定期清洗，特别是盛水、缓冲液和混合溶液的瓶子，以除去底部的杂质沉淀和可能生长的微生物。因甲醇有防腐作用，所以盛甲醇的瓶子无此现象。
7．卤代有机溶剂应特别注意的问题
卤代溶剂可能含有微量的酸性杂质，能与HPLC系统中的不锈钢反应。卤代溶剂与水的混合物比较容易分解，不能存放太久。卤代溶剂（如CCl4、CHCl3等）与各种醚类（如乙醚、二异丙醚、四氢呋喃等）混合后，可能会反应生成一些对不锈钢有较大腐蚀性的产物，这种混合流动相应尽量不采用，或新鲜配制。此外，卤代溶剂（如CH2Cl2）与一些反应性有机溶剂（如乙腈）混合静置时，还会产生结晶。总之，卤代溶剂最好新鲜配制使用。如果是和干燥的饱和烷烃混合，则不会产生类似问题。

8．HPLC用水
HPLC应用中要求超纯水，如检测器基线的校正和反相柱的洗脱。
进行HPLC、GC、电泳和荧光分析，或在涉及组织培养时，没有有机物污染是非常重要的。测高锰酸钾颜色保留时间的定性方法反应慢，对很低水平的有机物（对HPLC可能还是太高了）不够灵敏，特别是不能定量。总有机碳(TOC)分析仪（把有机物氧化成CO2，测游离的CO2）常用于I类（NCCLS）水中低浓度有机物的测定。
I类水标准：
NCCLS ASTM
电阻率，MΩcm，25℃，最小 10.0 18.0
硅酸盐，mg/L，最大 0.05 0.003
微粒，µm滤器 0.22 0.2
微生物，CFU/ml 10 分三档
美国药典24版（2000年）要求TOC＜0.5 mg/L（用标准蔗糖溶液1.19 mg/L），电导率在室温pH 6时≤2.4 µS/cm（即≥0.42 MΩcm）。HPLC级水增加吸收特性：在1cm池中，用超纯水作空白，在190nm、200nm和250~400nm的吸收度分别不得过0.01、0.01和0.05。增加不挥发物，≤3ppm（中国药典纯水≤10ppm）。

9、HPLC应用
(一)、样品测定
1．流动相比例调整：由于我国药品标准中没有规定柱的长度及填料的粒度，因此每次新开检新品种时几乎都须调整流动相（按经验，主峰一般应调至保留时间为6~15分钟为宜）。所以建议第一次检验时请少配流动相，以免浪费。弱电解质的流动相其重现性更不容易达到，请注意充分平衡柱。
2．样品配制：①溶剂；②容器：塑料容器常含有高沸点的增塑剂，可能释放到样品液中造成污染，而且还会吸留某些药物，引起分析误差。某些药物特别是碱性药物会被玻璃容器表面吸附，影响样品中药物的定量回收，因此必要时应将玻璃容器进行硅烷化处理。
3．记录时间：第一次测定时，应先将空白溶剂、对照品溶液及供试品溶液各进一针，并尽量收集较长时间的图谱（如30分钟以上），以便确定样品中被分析组分峰的位置、分离度、理论板数及是否还有杂质峰在较长时间内才洗脱出来，确定是否会影响主峰的测定。
4．进样量：药品标准中常标明注入10ml，而目前多数HPLC系统采用定量环（10ml、20ml和50ml），因此应注意进样量是否一致。（可改变样液浓度）
5．计算：由于有些对照品标示含量的方式与样品标示量不同，有些是复合盐、有些含水量不同、有些是盐基不同或有些是采用有效部位标示，检验时请注意。
6．仪器的使用：
a.流动相滤过后，注意观察有无肉眼能看到的微粒、纤维。有请重新滤过。
b.柱在线时，增加流速应以0.1ml/min的增量逐步进行，一般不超过1ml/min，反之亦然。否则会使柱床下塌，叉峰。柱不线时，要加快流速也需以每次0.5ml/min的速率递增上去（或下来），勿急升（降），以免泵损坏。
c.安装柱时，请注意流向，接口处不要留有空隙。
d.样品液请注意滤过（注射液可不需滤过）后进样，注意样品溶剂的挥发性。
e.测定完毕请用水冲柱1小时，甲醇30分钟。如果第二天仍使用，可用水以低流速（0.1~0.3ml/min）冲洗过夜（注意水要够量），不须冲洗甲醇。另外需要特别注意的是：对于含碳量高、封尾充分的柱，应先用含5~10%甲醇的水冲洗，再用甲醇冲洗。
f.冲水的同时请用水充分冲洗柱头（如有自动清洗装置系统，则应更换水）。
(二)、方法研究
1．波长选择：首先在可见紫外分光光度计上测量样品液的吸收光谱，以选择合适的测量波长，如最灵敏的测量波长并避开其它物质的干扰。从紫外光谱中还可大体知道在HPLC中的响应值，如吸收度小于0.5时，HPLC测定的面积将会很小。
2．流动相选择：尽量采用不是弱电解质的甲醇-水流动相。

十一、高效液相色谱仪实验室建设要求
土建要求：
液相色谱室地面一般是水磨石地面和地板，色谱台高0.75米，宽0.80米，台面离墙0.5米，采用水磨石板，上面铺胶皮板，液相色谱不易和气相色谱放在一个房间，液相色谱室要配备样品处理间，样品处理间要有通风橱，上下水，药品柜。
电路要求：
单相三线（火、零、地），仪器多的色谱室三相五线，电压220V±5V，地线良好。
通风要求：
液相色谱室有有机气体，因此要有良好的通风，在仪器上方安装排风罩，采用屋顶风机，
室温要求：
一般在房间靠走廊侧墙的下边离地面200mm高设400×400mm的百叶通风口。液相色谱室温度一般要求在22-27℃，大的化验室都采用整体空调，空调出风口要设在房间的上部。

十二、常用术语A：吸收度，也作面积CAN：乙腈（acetonitrile）B（%B）：二元流动相中的强溶剂（% v/v）C8，C18：烷基键合相的键长度（八烷基或十八烷基）CD：环糊精（cyclodextrin）CV：变异系数（通常以%表示）； dC：色谱柱内径（cm）dP：颗粒直径(μm)DAD：二极管阵列检测器EC：电化学(检测器)F：流速(ml/min)FL：荧光(检测器)GS：梯度斜度参数；k*=20/GSh'：峰高HP：惠普公司(Hewlett-Peckard)HPLC：高效液相色谱ID：内径，dCIEC：离子交换色谱（ion-exchange chromatography）IPC：离子对色谱 (ion-paire chromatography)k：保留因子k*：梯度洗脱中,k的有效值或平均值ka，kZ：色谱图中，首峰（a）和末峰（z）的k值L：色谱柱长度（cm）LC-MS：液相色谱-质谱M：分子量MC：二氯甲烷（methylene chloride）MeOH：甲醇(methanol)MS：质谱MTBE：甲基-叔-丁醚（methyl-t-butyl ether）N：色谱柱塔板数N'：噪音NARP：非水反相HPLCNPC：正相色谱P：色谱柱压力降(通常以psi表示) pKa：酸或供质子碱的酸性常数PAH：多环芳烃(polyaromatic hydrocarbon)RS：分离度RI：折光指数RPC：反相色谱 S：信号; tD：延迟或滞留时间(min,用于梯度洗脱中);等于VD/FtG：梯度时间(min)tR：保留时间(min)；等于tO(1+k)tRa,tRz：色谱图中首峰（a）与末峰（z）的保留时间，tR（min）tO：色谱柱死时间(min) t1,t2：相邻谱峰1与谱峰2的保留时间(min)TEA：三乙胺(triethylamine)TEA：四氢呋喃(tetrahydrofuran)UV：紫外光谱VD：延迟或滞留体积(mL);为梯度混合器与色谱柱人口之间的体积(包括混合器的体积)Vm：色谱柱死体积(mL);Vm为色谱柱内部的流动相体积,不包括附于固定相上的溶剂Vmax：最大样品体积(mL) Va：样品体积(mL)w：重量(mg);也作半峰高处的峰宽(min)wmax：不超载色谱柱的最大进样量(mg) wS：色谱柱的饱和容量(mg) W：峰底宽(min) Wth：大进样量对峰底宽的贡献(min) WO：小进样量的峰底宽(min)W1/2：半峰高处的峰宽(min) a：分离因子,等于k2/k1,其中k2与k1分别为相邻谱峰2和谱峰1的k值△tR：tRz-tR(min)△%B：梯度洗脱期间,%B的变化ε：摩尔吸收系数εo：正相HPLC 中溶剂或溶剂混合液的强度η：粘度(CP)<<不常有符号>> C：谱峰最大值处的浓度(mol/L)CO：注入样品中溶质的浓度(mol/L)GI：化学电离(MS)DGA：N,N-二甲基-1-萘酰胺;(也作二甲基苯胺dimethylaniline)EI：电子电离(MS)ELS：蒸发光散射击(Evaporative light scattering)EtOAc：乙酸乙酯(ethyl acetate)FAB：快速原子轰击(MS)FD：场解吸附(MS)h：折合板高,等于H/dPHB：羟基苯甲酸(hydrxybenzoic acid) HFBA：七氟丁酸(hyptafluorobutyric acid)IPA：异丙醇(isopropanol)kW：以水作为流动相的k值LCEC：液相色谱电化学检测器LD：激光解吸(MS)LSIMS：液态二级离子质谱MALDI：基质辅助激光解吸电离MP：对羟苯甲酸甲酯[P-]m：流动相中离子对试剂P-的浓度(mmol/L)PAD：脉冲电流分析检测器PBP：极性键合相PD：等离子解吸(MS)PP：对羟苯甲酸丙酯PTH：乙内酰苯硫脲R+,R-：分别为阴离子与阳离子离子交换色谱柱中的荷电功能基困 [如-N(CH3)3+和-SO3-]RF：响应因子TBA+：四丁基铵离子tBME：见MTBETMS：三甲基硅烷(trimethylsilyl;也为C1)TNB：1,3,5-三硝基苯(1,3,5-trinitrobenzene)TOF MS：时间飞行质谱TSP：热喷雾(MS)u：流动相通过色谱柱的速度(cm/s);等于L/toV：峰底宽(mL)Vc：色谱柱内峰展宽对V的贡献;也作小样品量峰底宽(mL)(式2.16)VR：保留体积(mL) W：峰宽(min) Wc，WS，：分别为色谱柱，进样器，连续管和流通池对W的贡献（min） X,X1,：无特征结构的溶质XB：流动相中的B溶剂的摩尔分数V：折合速度,等于udp/Dmб：高斯曲线的标准偏差;等于峰底的1/4ι：检测器响应时间常数(S)φ：流动相中B溶剂的体积分数;等于0.01%B

好全的知识，顶一下，不知道什么时候才能完全掌握这个机器唉

很详细的液相资料!!学习先!!

俺也赶紧学习啦

猪哥哥能否给发一些蒸发光散射检测器的资料，，俺们刚上了一台没有经验