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主题：【资料】PCR知识分享

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发表于：2010/10/21 14:06:01 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

【PCR仪的种类】
　　分类总是五花八门，总体来说可以分为PCR扩增仪和实时荧光PCR仪两大类，有人也把它们称为半自动和全自动，或者定性和定量，都是比较不准确的称呼。

　　PCR最重要的就是个升降温过程，最初的水浴锅式PCR，就是三个水浴箱，一个机械臂，定时抓出反应槽转换水浴锅。这种东东体积大，迅速慢，但其实结果并不比以后的PCR仪差，我现在都很欣赏。后来有人利用致冷和加热做成了，固定位置升降温的PCR扩增仪。

　　后来随着定量技术的发展，有公司将扩增仪和检测做成一体，也就成了现在所谓的全自动（或定量）PCR仪。当然标准的叫实时荧光定量PCR仪。

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2010/10/21 14:06:29 沙发管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

【品牌】

　　什么东西都有品牌，现在国内国外PCR仪的品牌很多，就国外而言比较著名的有：

　　ABI美国应用生物公司：老牌的生物公司贵族，其收购了原来的PE，而PE公司是PCR的鼻祖，旗下有很多经典的PCR仪，有5700（已停产）、7700（已停产）、7000、7900等实时荧光定量PCR仪。

　　ROCHE罗氏诊断：炙手可热的新贵，LIGHTCYCLER是其唯一的PCR仪，市场做得很不错，以科研定位为主，但在国内很多医院使用，其很特色离心、气加热、毛细管等，设计另类，是最有特色的PCR仪，当然好坏另议，就单其另辟蹊径的技术能力和胆识就值的佩服。

　　MJ：刚入中国的名流，MJ的扩增仪在生命科研领域比较出名，其产品比较适合高通量检测，人类基因组计划用得很多。其实时荧光PCR仪刚进入中国不久，孔间能使用不同温度是其特色。这点其实比较有用。

　　伯乐：呵，廉价的麦当劳，ICYCLER是其主打，进入中国已经比较久了，产品和5700一样，是扩增仪上加装定量模块而成，特点是价格较低。

　　国内现在做的也很多，比如杭州博日、杭州朗基、上海枫岭、厦门安普利等。

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2010/10/21 14:06:51 板凳管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

【选购】

　　准确的讲包括实时荧光定量在内都没有自动加样和标本处理系统，只能算半自动的。PCR仪是个简单的东东，一个温控设备和一个检测设备而已。

　　关于温控，主要是介质问题。理想的介质是导热性好、比热大、接触紧密的东东。

　　这方面最好的是水浴和油浴，比热大（油比水更大）、溶剂化物体，与反应物无缝接触，效果当然最好。但是自动化，小型化难，只有最初的水浴锅式使用。

　　硅加热，这是使用最普遍的一种，优点：易自动化、速度快、直接加热降温，效果当然好，但是第一成本较高，第二其使用的介质是金属，导热虽然好，但是与反应管，很难做到无缝接触，定性时代可以加油，但用荧光定最，由于油有荧光信号不能用。所以在无缝接触上差一些。第三由于是底部加热，下部压力较大，有溢出的可能，不过新的仪器在加热盖以后解决了这个问题。

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2010/10/21 14:07:19 马扎管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

空气加热，用空气做介质有优点，与反应体系无缝接触，但是空气的导热性差、比热小的弱点明显。因此空气加热的要利用离心来产生空气流动，增强导热性，同时使用毛细管，加大接触面积、试剂微量化来弥补。这样做了以后效果还是不错。但有的厂商把什么离心、毛细管的好处大讲特讲，对气加热的弱点闭口不谈，却是高明的市场手法。同时，使用离心，对标本量增大是有影响的并且标本量越大，空气比热小的弱点就越明显，所以空所加热的仪器标本量都比较小。使用毛细管后由于反应液与管的接触面积增大，吸附现象更大，因此试剂的通用性差一般要专门开发，成本高，虽然试剂用量少，但因为是专用试剂，每人份就是以实际量算，并不省试剂。反而增加了毛细管成本。

　　关于功能，所有的PCR仪功能都大体相同。只有MJ孔间能使用不同温度比较独特，这对于多项目同时检测以及循环参数的调整比较有用。但其实时荧光的仪器刚进入中国不久，具体如何还不得而知。

　　关于选购，根据单位情况而定，由于PCR的技术含量其实并不高，好的国产仪器如杭州博日（与日本著名厂商大和有关）也差不太多。关于进口仪器，罗氏的仪器不错，但如果标本量大，建议不要用罗氏。一则会累死的。另外，每个标本要分摊的标准曲线、对照成本太高。同时，试剂也比较受限。

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2010/10/21 14:08:13 地毯管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

PCR仪常见问题及回答
1. cDNA产量的很低
可能的原因：
*RNA模板质量低
*对mRNA浓度估计过高
*反应体系中存在反转录酶抑制剂或反转录酶量不足
*同位素磷32过期
*反应体积过大，不应超过50μl

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2010/10/21 14:08:31 地板管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

2. 扩增产物在电泳分析时没有条带或条带很浅
*最常见的原因在于您的反应体系是PCR的反应体系而不是RT-PCR的反应体系
*与反应起始时RNA的总量及纯度有关
*建议在试验中加入对照RNA
*第一链的反应产物在进行PCR扩增时，在总的反应体系中的含量不要超过1/10
*建议用Oligo(dT)或随机引物代替基因特异性引物（GSP）用于第一链合成。由于RNA模板存在二级结构，如环状结果，有可能导致GSP无法与模板退火；或SSⅡ反转录酶无法从此引物进行有效延伸。
*目的mRNA中含有强的转录中止位点，可以试用以下方法解决：
a. 将第一链的反应温度提高至50℃。
b. 使用随机六聚体代替Oligo(dT)进行第一链反应。

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2010/10/21 14:08:50 6楼管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

3. 产生非特异性条带
*用RT阴性对照检测是否被基因组DNA污染。如果RT阴性对照的PCR结果也显示同样条带，则需要用DNase I重新处理样品。
*在PCR反应中，非特异的起始扩增将导致产生非特异性结果。在低于引物Tm 2至5℃的温度下进行退火，降低镁离子或是目的DNA的量将减少非特异性结果的产生。
*由于mRNA剪切方式的不同，根据选择引物的不同将导致产生不同的RT-PCR结果。

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