主题：【分享】高效液相色谱分析方法

2  高效液相色谱的主要类型及其分离原理

根据分离机制的不同，高效液相色谱法可分为下述几种主要类型：液-液色谱法、液-固色谱法、离子交换色谱法、离子对色谱法、离子色谱法和空间排阻色谱法等。

2.1 液-掖分配色谱法及化学键合相色谱

流动相和固定相都是液体。从理论上说，流动相与固定相之间应互不相溶，两者之间有一个明显的分界面。试样溶于流动相后，在色谱柱内经过分界面进入固定液（固定相）中，由于试样组分在固定相和流动相之间的相对溶解度存在差异，因而溶质在两相间进行分配。

液-液分配色谱法与气-液分配色谱法之间有相似之处，即分离顺序决定分配系数的大小，分配系数大的组分保留值大；但也有不同之处，气相色谱法中流动相的性质对分配系数影响不大，而液相色谱法中流动相的种类对分配系数却有较大的影响。

在液-液色谱法中，一般为了避免固定液的流失，对于亲水性固定液常采用疏水性流动相，即流动相的极性小于固定液的极性，这种情况称为正相液-液色谱法。反之，若流动相的极性大于固定液的极性，则称为反相液-液色谱法，这是因为后者的出峰顺序正好与正相液-液色谱相反的缘故。但是在色谱分离过程中由于固定液在流动相中仍有微量溶解，以及流动相通过色谱柱时的机械冲击，固定液会不断流失而导致保留行为的变化，柱效和分离选择性变坏等不良后果。为了更好地解决固定液从载体流失的问题，将各种不同有机基团通过化学反应共价键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上，代替机械涂渍的液体固定相，从而产生了化学键合固定相，为色谱分离开辟了广阔的前景。自20世纪70年代末以来，液相色谱分析工作有70％~80％是在化学键合固定相上进行的。它不仅用于反相色谱法、正相色谱法，还用于离子交换色谱法、离子对色谱法等色谱技术上。其中特别是反相化学键合相色谱法。

2.2  液-固色谱法

流动相为液体，固定相为吸附剂。这是根据物质吸附作用的不同来进行分离的。其作用机制是溶质分子（X）和溶剂分子（S）对吸附剂活性表面的竞争吸附。

2.3 离子交换色谱法

离子交换色谱法是基于离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，依据这些离子对交换剂具有不同的亲和力而将它们分离。凡是在溶剂中能够电离的物质通常都可以用离子交换色谱法来进行分离。

离子交换色谱法主要用来分离离子或可离解的化合物，它不仅应用于无机离子的分离，例如稀土化合物及各种裂变产物，还用于有机物的分离，20世纪60年代前后，已成功地分离了氨基酸、核酸、蛋白质等，在生物化学领域得到了广泛的应用。

2.4 离子色谱法

离子色谱法是20世纪70年代中期发展起来的一项新的液相色谱法，很快便发展成为水溶液中阴离子分析的最佳方法。在这种方法中用离子交换树脂为固定相，电解质溶液为流动相。

3  液相色谱法固定相

高效色谱柱是高效液相色谱的心脏，而其中最关键的是固定相及其填装技术。现按液相色谱法的几种类型所用固定相分述如下。

3.1  液-液色谱法

液-液色谱法及离子对色谱法所用的担体可分为如下几类。

全多孔型担体  高效液相色谱法早期使用的担体与气相色谱法相类似，是颗粒均匀的多孔球体，例如由氧化硅、氧化铝、硅藻土制成的直径为100μm左右的全多孔型担体。

表层多孔型担体  它是直径为30~40μm的实心核（玻璃微珠），表层上附有一层厚度约为1~2μm的多孔表面（多孔硅胶）。由于固定相仅是表面很薄一层，因此传质速度快，加上是直径很小的均匀球体，装填容易，重现性较好，因此在20世纪70年代前期得到较广泛使用。但是由于比表面积较小，因此试样容量低，需要配用较高灵敏度的检测器。随着近年来对全孔微粒担体的深入研究和装柱技术的发展，目前粒度为5~10μm的全多孔微粒担体是使用最广泛的高效填料。

从原则上讲，气相色谱用的固定液。只要不和流动相互溶，就可用作液-液色谱固定液。但考虑到早液-液色谱中流动相也影响分离，故在液-液色谱中常用的固定液只有极性不同的几种，如强极性的β，β‘一氧二丙腈，中等极性的聚乙二醇-400和非极性不同的角鲨烷等。

3.2 液-固吸附色谱法固定相

液-固吸附色谱法采用的吸附剂有硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等，如前所述，仍可分为全多孔型和薄壳型两种，其特点如前述。目前较常使用的是5~10μm的硅胶微粒（全多孔型）。

4  高效液相色谱仪

近年来，高效液相色谱技术得到了极其迅猛的发展。仪器的结构和流程也是多种多样的。高效液相色谱仪一般都备贮液器、高压泵、梯度洗提装置、进样器、色谱柱、检测器、恒温器、记录仪等主要部件。

4.1  高压泵

液相色谱分析的流动相（载液）是用高压泵来输送的。由于色谱柱很细（1~6㎜），填充剂粒度小（目前常用颗粒直径为5~10μm），因此阻力很大，为达到快速、高效的分离，必须有很高的柱前压力，以获得高速的液流。对高压输液泵来说，一般要求压力为150~350×105Pa，关键是要流量稳定，因为它不仅影响柱效能，而且直接影响到峰面积的重现性和定量分析的精密度。

4.2  梯度洗提装置

高效液相色谱法中的梯度洗提，和气相色谱法中的程序升温一样，给分离工作带来很大的方便，现在已成为完整的高效色谱仪中一个重要的不可缺少的部分。所谓梯度洗提，就是载液中含有两种（或更多）不同极性的溶剂，在分离过程中按一定的程序连续改变载液中溶剂的配比和极性，通过载液中极性的变化来改变被分离组分的分离因素，以提高分离效果。应用梯度洗提还可以使分离时间缩短，分辨能力增加，由于峰形的改善，还可以提高最小检测量和定量分析的精度。

4.3  进样装置

在高效液相色谱中，进样方式及试样体积对柱效很大的影响。要获得良好的分离效果和重现性，需要将试样“浓缩”地瞬时注入到色谱柱上端柱担体的中心成一个小点。如果把试样注入到柱担体前的流动相中，通常会使溶质以扩散形式进入柱顶，就会导致试样组分分离效能的降低。目前，符合要求的进样方式主要有以下两种。

4.3.1注射器进样装置  这种进样方式同气相色谱法一样，试样用微量注射器刺过装有弹性隔膜的进样器，针尖直达上端固定相或多孔不锈钢滤片，然后迅速按下注射器芯，试样以小滴的形式到达固定相床底的顶端。缺点是不能承受高压，在压力超过150×105Pa后，由于密封垫的泄露，带压进样实际上成为不可能。为此可采用停流进样的方法。这时打开流动相泄露阀，使柱前压力下降至零，注射器按前述方法进样后，关闭阀门是流动相压力恢复，把试样带入色谱柱。由于液体的扩散系数很小，试样在柱顶的扩散很缓慢，故停流进样的效果同样能达到不停流进样的要求。但停流进样方式无法取得精确的保留时间，峰形的重现性亦较差。

4.3.2  高压定量进样阀  这是通过进样阀（常用六通阀）直接向压力系统内进样而不必停止流动相的一种进样装置。

进样体积是由定量管的体积严格控制的，所以进样准确，重现性好，适于作定量分析，更换不同体积的定量管，可调整进样量。也可采用较大体积的定量管进少量试样，进样量由注射器控制，试样不充满定量管，而只是填充其一部分的体积。

5          色谱柱及流动相的选择（反相）

5.1 孔尺寸选择

如果溶质分子量小于4000，选择小孔（60-80?）填料柱；否则选用孔尺寸为300?的填料柱。

5.2 微粒尺寸选择

用于HPLC的填料微粒标准尺寸为5μm。。液相色谱柱发展的一个重要趋势是减小填料颗粒度（3~5μm）以提高柱效，这样可以使用更短的柱（数厘米），更快的分析速度。

5.3 柱配置

在建立分析方法时，一般推荐使用4.6×150mm。如果需要更高的分离度，可以使用较长的柱，其尺寸为4.6×250mm。

5.4 pH值及流动相

为了保证色谱柱的使用寿命，使用传统的反相色谱柱时，都要求流动相的pH值在2-8之间。现在开发C18系列反相填料，由于采用高密度表面键合技术，使它的pH稳定应用范围达到1.0-11.0。扩展pH稳定应用范围的好处很多，如含氮的碱性药物在酸性或中性流动相条件下，因带上正离子，导致样品在固定相上保留性能很差，无法理想分离。当流动相pH达到9-10时，样品则表现为中性特征，在反相键合硅球表面的保留性能大大提高。同样，酸性样品的保留性能在低pH值时达到最大。



6          检测器

一个理想的检测器应具有灵敏度高、重现性好、响应快、线性范围宽、适用范围广、对流动相流量和温度波动不敏感、死体积小等特性。

6.1  紫外光度检测器 

紫外光度检测器是液相色谱法广泛使用的检测器，它的作用原理是基于被分析试样组分对特定波长紫外光的选择性吸收，组分浓度与吸光度的关系遵守比尔定律。紫外光度检测器具有很高的灵敏度，最小检测浓度可达10-9g·Ml-1，因而即使是那些对紫外光吸收较弱的物质，也可用这种检测器进行检测。此外，这种检测器对温度和流速不敏感，可用于梯度洗提，其结构较简单，缺点是不适用于对紫外光完全不吸收的试样。

6.2光电二极管陈列检测器是紫外可见光度检测器的一个重要进展。在这类检测器中采用光电二极管陈列作检测元件，陈列由211个光电二极管组成，每一个二极管宽50μm，各自测量一窄段的光谱。在此检测器中先使光源发出的紫外或可见光通过液相色谱流通池，在此被流动相中的组分进行特征吸收，然后通过入射狭缝进行分光，使所得含有吸收信息的全部波长，聚焦在陈列上同时被检测，并用电子学方法及计算机技术对二极管陈列快速扫描采集数据。经计算机处理后可得到三维色谱—光谱图。

6.3 荧光检测器  荧光检测器是一种很灵敏和选择性好的检测器。很多物质，特别是具有对称共轭结构的有机芳环分子受紫外光激发后，能辐射出比紫外光波长较长的荧光，例如多环芳烃、维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物等，许多生化物质包括某些代谢产物、药物、氨基酸、胺类、甾族化合物都可用荧光检测器检测，其中某些不发射物质亦可通过化学衍生转变成能发出荧光的物质而得到检测。

7  高效液相色谱分离类型的选择

应用高效液相色谱法对试样进行分离、分析方法的选择，应考虑各种因素，其中包括试样的性质（相对分子质量、化学结构、极性、溶解度参数等化学性质和物理性质）、液相色谱分离类型的特点及应用范围、实验室条件（仪器、色谱柱等）等。

相对分子质量较低，挥发性较高的试样，适于用气相色谱法。标准的液相色谱类型（液-固、液-液、离子交换、离子对色谱、离子色谱等）适用于分离相对分子质量为200到2000的试样。



8  定性定量方法参照气相色谱法



9  应用

高效液相色谱法是一项高效、快速的分离分析技术。它同气相色谱法一样，已成为环境监测与生物监测的重要工具。但高效液相色谱法更适宜分离分析高沸点、热稳定性差及相对分子质量比较大的物质。

9.1样品预处理