主题：【分享】高效液相色谱法分离技术

化学键合相层析分：7 G* V" b2 X! @
（1）极性键合相层析：固定相为极性基团，氰基、氨基及双羟基三种。流动相为非极性或极性较小的溶剂。极性小的组份先出峰，极性大的后出峰，这称为正相层析法，适用于分离极性化合物。
（2）非极性键合相层析：固定相为非极性基团，如十八烷基（C18）、辛烷基（C8）、甲基与苯基等，流动相用强极性溶剂，如水、醇、乙腈或无机盐缓冲液。最常用的是不同比例的水和甲醇配制的混合溶剂，水不仅起洗脱作用还可掩盖载体表面的硅羟基，防止因吸附而至的拖尾现象。极性大的组份先出峰，极性小的组份后出峰，恰好与正相法相反，故称反相层析。本法适用于小分子物质的分离，如肽、核苷酸、糖类、氨基酸的衍生物等。
离子对分配层析分：! ]$ D5 b, l: H: E! F, （1）正相离子对层析：此法常以水吸附在硅胶上作为固定相，把与分离组份带相反电荷的配对离子以一定浓度溶于水或缓冲液涂渍在硅胶上。流动相为极性较低的有机溶剂。在层析过程中，待分离的离子与水相中配对离子形成中性离子对，在水相和有机相中进行分配，而达到分离。本法优点是流动相选择余地大，缺点是固定相易流失。
（2）反向离子对层析：固定相是疏水性键合硅胶，如C18键合相，待分离离子和带相反电荷的配对离子同时存在于强极性的流动相中，生成的中性离子对在流动相和键合相之间进行分配，而得到分离。本法优点是固定相不存在流失问题、流动相含水或缓冲液更适用于电离性化合物的分离。, O0 l+ x1 ^( k1 X3 ^4 M
液 — 固色谱法
流动相为液体，固定相为吸附剂（如硅胶、氧化铝等）。这是根据物质吸附作用的不同来进行分离的。其作用机制是：当试样进入色谱柱时，溶质分子 (X) 和溶剂分子(S)对吸附剂表面活性中心发生竞争吸附（未进样时，所有的吸附剂活性中心吸附的是S），可表示如下：
Xm + nSa ====== Xa + nSm
式中：Xm--流动相中的溶质分子；Sa--固定相中的溶剂分子；Xa--固定相中的溶质分子；Sm--流动相中的溶剂分子。
当吸附竞争反应达平衡时：K=[Xa][Sm]/[Xm][Sa] M/ g2 [( h! ]1 p
式中：K为吸附平衡常数。[讨论：K越大，保留值越大。]
液-固吸附层析中的流动相依其所起的作用不同，分为“底剂”和洗脱剂两类，底剂起决定基本色谱的分离作用，洗脱剂起调节试样组份的滞留时间长短，并对试样中某几个组份具有选择性作用。流动相中底剂与洗脱剂成分的组合和选择，直接影响色谱的分离情况，一般底剂为极性较低的溶剂，如正已烷、环已烷、戊烷、石油醚等，洗脱剂则根据试样性质选用针对性溶剂，如醚、酯、酮、醇和酸等。本法可用于分离异构体、抗氧化剂与维生素等。. Q& F7 L: w- v/ c4 Y) a& O
离子交换色谱法(Ion-exchange Chromatography) s" s% u4 T
IEC是以离子交换剂作为固定相。IEC是基于离子交换树脂上可电离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，依据这些离子以交换剂具有不同的亲和力而将它们分离。
以阴离子交换剂为例，其交换过程可表示如下：X-(溶剂中) + (树脂-R4N+Cl-)=== (树脂-R4N+ X-) + Cl- (溶剂中)
当交换达平衡时：KX=[-R4N+ X-][ Cl-]/[-R4N+Cl-][ X-]
分配系数为：DX=[-R4N+ X-]/[X-]= KX [-R4N+Cl-]/[Cl-] % H* b3 J5 O; y+ L+ d) e
[讨论：DX与保留值的关系]3 U: i* s+ D, ]' H) I& J凡是在溶剂中能够电离的物质通常都可以用离子交换色谱法

来进行分离。 在离子交换HPLC中，固定相多用离子性键合相，故本法又称离子性键合相层析。流动相主要是水溶液，pH值最好在被分离酸、碱的pK值附近。
离子对色谱法(Ion Pair Chromatography)离子对色谱法是将一种 ( 或多种 ) 与溶质分子电荷相反的离子 ( 称为对离子或反离子 ) 加到流动相或固定相中，使其与溶质离子结合形成疏水型离子对化合物，从而控制溶质离子的保留行为。其原理可用下式表示：X+水相 + Y-水相 === X+Y-有机相式中：X+水相--流动相中待分离的有机离子（也可是阳离子）；Y-水相--流动相中带相反电荷的离子对（如氢氧化四丁基铵、氢氧化十六烷基三甲铵等）；X+Y---形成的离子对化合物。7 w4 q! w/ u0 a2 @
当达平衡时： KXY = [X+Y-]有机相/[ X+]水相[Y-]水相- g! @$ Z- S% `# p
根据定义，分配系数为： DX= [X+Y-]有机相/[ X+]水相= KXY [Y-]水相
[讨论：DX与保留值的关系]
离子对色谱法(特别是反相)发解决了以往难以分离的混合物的分离问题，诸如酸、碱和离子、非离子混合物，特别是一些生化试样如核酸、核苷、生物碱以及药物等分离。离子色谱法(Ion Chromatography)# ?8 u+ g" c7 G3 w7 ?, T" [
用离子交换树脂为固定相，电解质溶液为流动相。以电导检测器为通用检测器，为消除流动相中强电解质背景离子对电导检测器的干扰，设置了抑制柱。试样组分在分离柱和抑制柱上的反应原理与离子交换色谱法相同。
以阴离子交换树脂（R-OH）作固定相，分离阴离子（如Br-）为例。当待测阴离子Br-随流动相（NaOH）进入色谱柱时，发生如下交换反应（洗脱反应为交换反应的逆过程）：
抑制柱上发生的反应： 9 R, K& I; L& p( Q
R-H+ + Na+OH- === R-Na+ + H2O ( `( C' A5 O+ O; h
R-H+ + Na+Br- === R-Na+ + H+Br-
可见，通过抑制柱将洗脱液转变成了电导值很小的水，消除了本底电导的影响；试样阴离子Br-则被转化成了相应的酸H+Br-，可用电导法灵敏的检测。
离子色谱法是溶液中阴离子分析的最佳方法。也可用于阳离子分析。
空间排阻色谱法(Steric Exclusion Chromatography)
空间排阻色谱法以凝胶 (gel) 为固定相。它类似于分子筛的作用，但凝胶的孔径比分子筛要大得多，一般为数纳米到数百纳米。溶质在两相之间不是靠其相互作用力的不同来进行分离，而是按分子大小进行分离。分离只与凝胶的孔径分布和溶质的流动力学体积或分子大小有关。试样进入色谱柱后，随流动相在凝胶外部间隙以及孔穴旁流过。在试样中一些太大的分子不能进入胶孔而受到排阻，因此就直接通过柱子，首先在色谱图上出现，一些很小的分子可以进入所有胶孔并渗透到颗粒中，这些组分在柱上的保留值最大，在色谱图上最后出现。% @,高效液相色谱分离方法的选择：要正确地选择色谱分离方法，首先必须尽可能多的了解样品的有关性质，其次必须熟悉各种色谱方法的主要特点及其应用范围。选择色谱分离方法的主要根据 是样品的相对分子质量的大小，在水中和有机溶剂中的溶解度，极性和稳定程度以及化学结构等物理、化学性质。$ e3 H2 K: w' X
1.相对分子质量：对于相对分子质量较低（一般在200以下），挥发性比较好，加热又不易分解的样品，可以选择气相色谱法进行分析。相对分子质量在200 ~ 2000的化合物，可用液固吸附、液-液分配和离子交换色谱法。相对分子质量高于2000，则可用空间排阻色谱法。1 B2.溶解度：水溶性样品最好用离子交换色谱法和液液分配色谱法；微溶于水，但在酸或碱存在下能很好电离的化合物，也可用离子交换色谱法；油溶性样品或相对非极性的混合物，可用液-固色谱法。
化学结构* @0： K% N1 K0 |) g* F若样品中包含离子型或可离子化的化合物，或者能与离子型化合物相互作用的

化合物（例如配位体及有机螯合剂），可首先考虑用离子交换色谱，但空间排阻和液液分配色谱也都能顺利地应用于离子化合物；异构体的分离可用液固色谱法；具有不同官能团的化合物、同系物可用液液分配色谱法；对于高分子聚合物，可用空间排阻色谱法。6 [4 y9 F+ _4 N8 l  H"
四、高效液相色谱柱的选择
硅胶基质填料
1、正相色谱
正相色谱用的固定相通常为硅胶（Silica）以及其他具有极性官能团胺基团，如（NH2，APS）和氰基团（CN，CPS）的键合相填料。% n$ z% v$ Q+ i% z, n; b
由于硅胶表面的硅羟基（SiOH）或其他极性基团极性较强，因此，分离的次序是依据样品中各组分的极性大小，即极性较弱的组份最先被冲洗出色谱柱。正相色谱使用的流动相极性相对比固定相低，如正已烷（Hexane），氯仿（Chloroform），二氯甲烷（Methylene Chloride）等。9 l. k( D& F, ^
2、反向色谱 5 D( v; I/ _( D' k5 Q" H0 f4 P
反向色谱用的填料常是以硅胶为基质，表面键合有极性相对较弱官能团的键合相。反向色谱所使用的流动相极性较强，通常为水、缓冲液与甲醇、乙腈等的混合物。样品流出色谱柱的顺序是极性较强的组分最先被冲洗出，而极性弱的组分会在色谱柱上有更强的保留。常用的反向填料有：C18（ODS）、C8（MOS）、C4（Butyl）、C6H5（Phenyl）等。
聚合物填料聚合物填料多为聚苯乙烯—二乙烯基苯或聚甲基丙烯酸脂等，其重要优点是在PH值为1—14均可使用。相对于硅胶基质的C18填料，这类填料具有更强的疏水性；大孔的聚合物对蛋白质等样品的分离非常有效。现有的聚合物填料的缺点是相对硅胶基质填料，色谱柱柱效较低。其它无机填料 . a4 O) T* D+ C" Z' j
其它HPLC的无机填料色谱柱也已经商品化由于其特殊的性质，一般仅限于特殊的用途。如，石墨化碳黑正逐渐成为反向色谱柱填料。这种填料的分离不同于硅胶基质烷基键合相，石墨化碳的表面即是保留的基础，不再需其它的表面改性。该柱填料一般比烷基键合相硅胶或多孔聚合物填料的保留能力更强。石墨化碳可用于分离某些几何异构体，由于在HPLC流动相中不会被溶解，这类柱可在任何PH与温度下使用。氧化铝也可以用于HPLC。氧化铝微粒刚性强，可制成稳定的色谱柱柱床，其优点是可以在PH高达12的流动相中使用。但由于氧化铝与碱性化合物的作用也很强，应用范围受到一定限制，所以未能广泛应用。新型色谱氧化锆基质填料也可用于HPLC。商品化的只有聚合物涂层的多孔氧化锆微球色谱柱，应用PH1-14，温度可达100℃。由于氧化锆填料是最近几年才开始研究，加之面临的实验难度，其重要用途与优势尚在进行之中。9 k: v6 G  G2 W
怎样选择填料粒度呢？目前，商品化的色谱填料粒度从1um到超过30um均有销售，而目前分析分离主要用3和5um填料进行。填料的粒度主要影响填充柱的两个参数，即柱效和背压。粒度越小，柱压越大，柱压的增加限制了粒度小于3um的填料应用。在相同选择性条件下，提高柱效可提高分离度，但不是唯一的因素。如果固定相选择是正确，但是分离度不够，那么选用更小的粒度的填料是很有用的。3um填料填充柱的柱效比相同条件下的5um填料的柱效提高近30%；然而，3um的色谱柱的背压却是5um的2倍。与此同时，柱效提高意味着在相同条件下可以选用更短的色谱柱，即相同的塔板数或分离能力，但是柱长更短，以缩短分

析时间。另外，可以采用低粘度的溶剂做流动相或增加色谱柱的使用温度，比如用乙腈代替甲醇，以降低色谱柱的压力。
五、高效液相色谱仪操作步骤
1.    过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜。
2.    对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20分钟。
3.    打开HPLC工作站（包括计算机软件和色谱仪），连接好流动相管道，连接检测系统。 0
4.    ?进入HPLC控制界面主菜单，点击manual，进入手动菜单。
5.    有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。冲洗泵，直接在泵的出水口，用针头抽取。冲洗进样阀，需要在manual菜单下，先点击purge，再点击start，冲洗时速度不要超过10?ml/min。 " e. l1 D7 d2 n, u
6.    调节流量，初次使用新的流动相，可以先试一下压力，流速越大，压力越大，一般不要超过2000。点击injure，选用合适的流速，点击on，走基线，观察基线的情况。 ' ^8 N" Z; Z  ?7 ^' p" c( ?0 O
7.    设计走样方法。点击file，选取select?users?and?methods，可以选取现有的各种走样方法。若需建立一个新的方法，点击new?method。选取需要的配件，包括进样阀，泵，检测器等，根据需要而不同。选完后，点击protocol。一个完整的走样方法需要包括：a.进样前的稳流，一般2-5分钟；b.基线归零；c.进样阀的loading-inject转换；d.走样时间，随不同的样品而不同。 # V5 k' m5 e- E% w  L" G
8.    进样和进样后操作。选定走样方法，点击start。进样，所有的样品均需过滤。方法走完后，点击postrun，可记录数据和做标记等。全部样品走完后，再用上面的方法走一段基线，洗掉剩余物。 , q8 C- h+ ]$ H. _0
9.    关机时，先关计算机，再关液相色谱。
10.    登记。
六、高效液相色谱仪使用注意
1. 色谱柱中的流动相会排干吗？, Z2 G8 z8 s3 N- T& n8 C# L7 a# |
不少做色谱分离试验的人遇到过这样的情形：不慎未及时补充流动相，泵将溶剂瓶中的流动相吸干了，HPLC系统由此而停止工作了。如此情况是否会损坏色谱柱？泵是否已将色谱柱中所有流动相都排干了？色谱柱还能使用吗？事实上，如果泵将溶剂瓶中的流动相吸干，并不会造成色谱柱的损坏。即使泵中充满了空气，泵也不会将空气排入色谱柱。因为泵只能输送液体，而不能输送空气。相比之下，另一个更可能发生的情况是忘记盖上色谱柱两端的密封盖或盖子太松而使色谱柱变干。同样，整个色谱柱干涸的情况不太容易发生，多半可能只是色谱柱两端的几个毫米变干了，因挥发掉所有溶剂是色谱柱变干需要相当长的时间。即使色谱柱真的变干了，也不一定就不可救药了。可以尝试用一种完全脱气的、表面张力低的溶剂（如经氦气脱气的甲醇）冲洗色谱柱以除去气体。较低的表面张力有助于浸润填料表面；已脱气的溶剂应该能够溶解并去除滞留在填料中的气体。色谱柱大约需要（以1mL/min的流速）冲一个小时或更多的时间被彻底浸润，恢复到正常状态。4 J4 A3 B3 Z" J: _" z2 E8 2. 使用PEEK（polyetheretherketone）管路和接头需要注意什么问题？如果经常需要改变流路或更换不同品牌的色谱柱，使用PEEK材料制成的管路和接头会非常方便。PEEK管路容易连接；PEEK接头不仅无需工具，手拧即可固定，而且容易调节锥箍之外的管路长度，方便与不同品牌或规格的色谱柱相连接。' W  p* ~  P" ?9 G8 K: E' k
使用此类材料的管路需要注意的是：PEEK对卤代烷烃和四氢呋喃的兼容性不好。虽然未观

察到上述溶剂溶解PEEK材料的明显迹象，但PEEK遇到上述溶剂会变脆。另一个西药考虑的因素是压力限。不锈钢管可耐受6000psi的压力，但PEEK管只能耐受近4000psi（但多数HPLC应用系统压力不会超过3000psi）。使用PEEK接头时则无需担心接头耐溶剂性能，因为接头几乎或很少与溶剂直接接触。但手拧固定的PEEK接头压力限低于不锈钢管，因而压力太高时，可能会使接头在管路上滑动而产生死体积或漏液。如何预防液相泵的故障:1 Y* K; z- h) w% \$ W
要保持泵的良好操作性能,必须维护系统的清洁,保证溶剂和试剂的质量,对流动相进行过滤和脱气.下面列出预防泵故障的几项措施:
（1） 用高质量试剂和HPLC级溶剂；
（2） 过滤流动相和溶剂；0 ]: Q; l$ L4 n' w- S
（3） 脱气；
（4） 每天开始使用时放空排气，工作结束后从泵中洗去缓冲液；% [6 K, [% F/ b' R/ x' A
（5） 不让水或腐蚀性溶剂滞留泵中；（6） 定期更换垫圈；; b1 f6 }1 s5 J# p0 z  x
（7） 需要时加润滑油；- y6 O+ c6 C0 }: |9 ~
（8） 查阅有关泵操作手册中的其它建议。 $ C. m* ~, s. z* G
处于良好操作状态的泵，应该能使色谱图上的基线平稳；保留时间的重复性好。在等度洗脱时压力波动小于2%。梯度洗脱时压力变化应是缓慢和平稳的。 + {, o; Y* @9 `
为了使故障发生后尽快排除，平时应常备密封、单向阀（入口与出口）、泵头装置、各式接头、保险丝等部件，以及更换工具。
七、高效液相色谱的常见问题分析
1. 涡流扩散（Eddy diffusion）8 a  A) X% S: K8 B( }, o0 k6 |' J
原因和解决方法：流动相碰到较大的固体颗粒，就像流水碰到石头一样产生涡流。如果柱装填得不均匀，有的部分松散或有细沟，则流动相的速度就快；有的部位结块或装直紧密则流就慢，多条流路有快有慢，就使区带变宽。因此，固相载体的颗粒要小而均匀，装柱要松紧均一，这样涡流扩散小，柱效率高。" L: p4 O, W/ \. [4 H' D
2. 分子扩散（Molecular diffusion）) Q0 S2 k$ a* Y
原因和解决方法：分子扩散就是物质分子由浓度高的区域向浓度低的区域运动，也称纵向分子扩散。要减少分子扩散就要采用小而均匀的固相颗粒装柱。同时在操作时，如果流速太慢，被分离物质停留时间长，则扩散严重。. k# h! c, a. l9 x$ k
3. 质量转移（Mass transfer）0 d/ r2 p; T, ^5 a$ C" p
原因和解决方法：被分离物质要在流动相与固定相中平衡，这样才能形成较窄的区带。在液相色谱中，溶质分子要在两个液相之间进行分配，或在固相上被吸附和解吸附均需要一定的时间。当流速快时，转移速度慢，来不及达到平衡动相就向前移，这各物质的非平衡移动，使区带变宽。
4. 动相流速+ E7 `6 r" t* c9 `4 H/ f: T: M

原因和解决方法：当流速太低时，分子扩散严重，特别是在气相色谱中尤为突出。如将理论塔板高度对流速作图，理论塔板高度随流速增加而急速下降，当达到最低值时，流速再加大则质量转移起主要作用，理论塔板高度又加大。在高效液相色谱中，流速稍快影响不大，但在凝胶过滤色谱中，因为物质要渗透到凝胶内部，所以质量转移影响大，流速加大会降低柱效率。
5. 固定相颗粒太小原因和解决方法：固定相颗粒越小柱效率越高，对流动相流动的阻力越大，需要加大压力才能使它流动。6 N8 i8 i, {7 ]4 m4 G* j1 Z/ j
6. 峰拖尾 ' E2 b" c$ Y6 A- P7 _2 F
原因和解决方法：5 z. X7 y- p/ N
（1）筛板阻塞，反冲色谱柱 ，更换进口筛板 ，更换色谱柱 ；. l% ^9 _4 k" N& L9 g8 b
（2）色谱柱塌陷，填充色谱柱； % a3 H4 L$ k; T( y) l
（3）干扰峰，使用更长的色谱柱，改变流动相或更换色谱柱； / q* _, ^. L5 I2 u; O, I1 a
（4）流动相PH选择错误  调整PH值。对于碱性化合物，低PH值更有利于得到对称峰； & P1 （5）样品与填料表面的溶化点发生反应，加入离子对试剂或碱性挥发性修饰剂，更改色谱柱。
7. 峰分叉I; S& ?& @0 I" Z
原因和解决方法：（1） 保护柱或分析柱污染，取下保护柱再进行分析，如果必要更换保护柱，如果分析柱阻塞，拆下来清洗，如果问题仍然存在，可能是柱子被强保留物质污染，运用适当的再生措施，如果问题仍然存在，入口可能被阻塞，更换筛板或更换色谱柱，
（2） 样品溶剂不溶于流动相 ，改变样品溶剂，如果可能采取流动相作为样品溶剂。
8. 早出的峰变形原因和解决方法：% f5 T% `, n$ S$ B3 P8 N- g
样品溶剂选择不恰当，减少进样体积，运用低极性样品溶剂。 ' N8 \$ K/ M& l# i" U0 p1 N# [
9. 早出的峰拖尾程度大于晚出的峰
原因和解决方法： 9 W8 @- M* g4 o* R  j8 |( W9 n
柱外效应，调整系统连接（使用更短、内径更小的管路），使用小体积的流通池。 , x. Y+ c5 Q) h+ a7 f' m
10.  K’增加时，脱尾更严重原因和解决方法：+ W  H8 e( b5 b
（1） 二级保留效应，反相模式，加入三乙胺（或碱性样品），加入乙酸（或酸性样品） ，加入盐或缓冲剂（或离子化样品），更换一支柱子； " ?1 P% c  E2 x" J* y' v- S1 |
（2） 二级保留效应，正相模式，加入三乙胺（或碱性样品），加入乙酸（或酸性样品） ，加入水（或多官能团化合物），试用另一种方法； 7 ^$ f$ F3 ^& p4 f! k! H3 `# y
（3） 二级保留效应，离子对，加入三乙胺（或碱性样品）。
11. 酸性或碱性化合物的峰拖尾原因和解决方法：缓冲不合适，使用浓度50-100mM的缓冲液，使用Pka等于流动相PH值的缓冲液。
12. 额外的峰4 ]5 _) N, b% b" a3 G; f
原因和解决方法： : ]! S3 L+ y8 x" w# b; R
（1） 样品中有其他组份，正常； ; w8 j# X/ ~% e1 f9 D  [
（2） 前一次进样的洗脱峰，增加运行时间或梯度斜率 ，提高流速； , c8 }2 `$ z- }
（3） 空位或鬼峰，检查流动相是否纯净，使用流动相作为样品溶剂，减少进样体积。
13. 保留时间波动原因和解决方法8 `$ o, t. E( V  X" E' g; E7 r( K
（1） 温控不当，调好柱温； 5 W/ i; D* U8 R0 W8 l/ n9 t

（2） 流动相组分变化，防止变化（蒸发、反应等）；( \* g2 y6 _- ^: }4 L+ L
（3） 色谱柱没有平衡，在每一次运行之前给予足够的时间平衡色谱柱。; C$ d+ c$ f- Q3 j
14. 保留时间不断变化" l( \6 t9 u) r) C* ~5 i
原因和解决方法：（1） 流速变化，重新设定流速 ；  E% H0 u1 `, G3 K( N' G3 @" P
（2） 泵中有气泡 ，从泵中除去气泡 ；（3） 流动相选择不恰当 ，更换合适的流动相，选择合适的混合流动相。
15. 基线漂移原因和解决方法：; `# Q. Z* R. r, @: Z# ]
（1） 柱温波动，（即使是很小的温度变化都会引起基线的波动，通常影响示差检测器、电导检测器、较低灵敏度的紫外检测器或其它光电类检测器）， 控制好柱子和流动相的温度，在检测器之前使用热交换器图； " v* G$ q( ^+ _' C
（2） 流动相不均匀，（流动相条件变化引起的基线漂移大于温度导致的漂移），使用HPLC级的溶剂，高纯度的盐和添加剂。流动相在使用前进行脱气，使用中使用氦气；（3） 流通池被污染或有气体，用甲醇或其他强极性溶剂冲洗流通池，如有需要，可以用1N的硝酸不要用盐酸）；5 n- L6 w1 U  T2 h
（4） 检测器出口阻塞，（高压造成流通池窗口破裂，产生噪音基线），取出阻塞物或更换管子，参考检测器手册更换流通池窗；（5） 流动相配比不当或流速变化，更改配比或流速，为避免这个问题可定期检查流动相组成及流速；（6） 柱平衡慢，特别是流动相发生变化时，用中等强度的溶剂进行冲洗，更改流动相时，在分析前用10-20倍体积的新流动相对柱子进行冲洗；$ C/ ~1 O8 T* G! l
（7） 流动相污染、变质或由低品质溶剂配成，检查流动相的组成，使用高品质的化学试剂及HPLC级的溶剂； ; x: R" u9 f; q) ]" S1 M, T
（8） 样品中有强保留的物质（高K’值）以馒头峰样被洗脱出，从而表现出一个逐步升高的基线， 使用保护柱，如有必要，在进样之间或在分析过程中，定期用强溶剂冲洗柱子；（9） 使用循环溶剂，但检测器未调整，重新设定基线，当检测器动力学范围发生变化时，使用新的流动相；
（10） 检测器没有设定在最大吸收波长处，将波长调整至最大吸收波长处。& u" h" q2 U! Z
16. 基线噪音（规则的）原因和解决方法：7 f( M9 Q$ r& [) S
（1） 在流动相、检测器或泵中有空气，流动相脱气，冲洗系统以除去检测器或泵中的空气；（2） 漏液，检查管路接头是否松动，泵是否漏液，是否有盐析出和不正常的噪音，如有必要，更换泵密封；（3） 流动相混合不完全，用手摇动使混合均匀或使用低粘度的溶剂；（4） 温度影响（柱温过高，检测器未加热），减少差异或加上热交换器；
（5） 在同一条线上有其他电子设备 断开LC、检测器和记录仪，检查干扰是否来自于外部，加以更正；; k$ J- y3 k: t; y' |* o
（6） 泵振动，在系统中加入脉冲阻尼器。 , A% B0 e1 O# H5 s' ]
17. 基线噪音（不规则的） $ p% d6 F8 }5 `
原因和解决方法：2 O# `! ?' w0 C' H( U  P! V. Q- P
（1） 漏液，检查接头是否松动，泵是否漏液，是否有盐析出和不正常的噪音，如有必要，更换密封，检查流通池是否漏液；2 T% q+ Z7 q' X4 S8 D
（2） 流动相污染、变质或由低质溶剂配成 ，检查流动相的组成；（3） 流动相各溶剂不相溶，选择互溶的流动相； 7 X/ U4 p3 L1 T0 X" Q5 P
（4） 检测器/记录仪电子元件的问题，断开检测器和记录仪的电源，检查并更正；（5） 系统内有气泡，用强极性溶液清洗系统；（6） 检测器内有气泡 ，清洗检测器，在检测器后面安装背景压力调节器；

（7） 流通池污染（即使是极少的污染物也会产生噪音），用1N的硝酸（不能用磷酸）清洗流通池； 6 ?$ r; q; S: C/ l8 m/ B' U2 d
（8） 检测器灯能量不足，更换灯；（9） 色谱柱填料流失或阻塞，更换色谱柱； ) v5 t! c2 O" Z. S. C9 K
（10） 流动相混合不均匀或混合器工作不正常，维修或更换混合器，在流动相不走梯度时，建议不使用泵的混合装置。 
18. 宽峰原因和解决方法：* g1 d( ^+ H2 C. Z" E* A
（1） 流动相组成变化，重新制备新的流动相 ；  t! Y# G& k1 V8 |1 d
（2） 流动相流速太低，调节流速；
（3） 漏液（特别是在柱子和检测器之间），检查接头是否松动、泵是否漏液、是否有盐析出以及不正常的噪音，如果必要更换密封；1 v$ v$ @0 b, t5 b
（4） 检测器设定不正确， 调整设定；（5） 柱外效应影响， 柱子过载，检测器对反应时间或池体积响应过大，柱子与检测器之间的管路太长或管路内径太大，记录仪响应时间太长 ，小体积进样（例如：10ul而不是100ul）以1：10或1：100的比例稀释样品， 减少响应时间或使用更小的流通池，使用内径为0.007-0.01的短管路，减少响应时间；
（6） 缓冲液浓度太低，增加浓度 ；' t( m6 E' D6 g8 t3 J  ~
（7） 保护柱污染或失效 ，更换保护柱 ；- R- `+ S& H. Z0 m
（8） 色谱柱污染或失效，塔板数较低，更换同样类型的色谱柱，如果新柱子可以提供对称的色谱峰，则用强溶剂冲洗旧柱子；（9） 柱入口塌陷，打开柱入口，填补塌陷或更换柱子；, z0 s% d( q0 I( o! M5 O; j
（10） 呈现两个或多个未被完全分离的物质的峰，选择其它类型的色谱柱以改善分离效果 ；( C  h& x% A0 c* z) n
（11） 柱温过低，提高柱温，除非特殊情况，温度不宜超过75℃ 12、检测器时间常数太大，使用较小的时间常数；
19. 分离度降低原因和解决方法：（1） 流动相污染或变质（引起保留时间变化），重新配置流动相 ；( c/ x, ^5 z. c: v
（2） 保护柱或分析柱阻塞图 ，去掉保护柱进行分析，如果必要则更换保护柱，如果分析柱阻塞，可进行反冲，如果问题仍然存在色谱柱可能被强保留的污染物损坏，建议使用恰当的再生程序，如果问题仍然存在，进口可能阻塞了，更换入口处的筛板或更换色谱柱。 8 h, F  q6 S&20. 所有的峰面积都太小 / V, @) _" g( O+ E0 h
原因和解决方法：（1） 检测器衰减设定过高，减少衰减的设定；2 O- O3 n& F7 }) d
（2） 检测器时间常数设定太大，设定较小的时间常数；（3） 进样量太少，增大进样量；
（4） 记录仪连接不当，使用正确的连接。
21. 所有的峰面积都太大
原因和解决方法： . X3 r) C1 I; J" f* b+ z1 b
（1） 检测器衰减设定过低，采取较大的衰减； ( L5 O+ l7 k% Z
（2） 进样过多，减少进样量 ；（3） 记录仪连接不正确，正确连接记录仪。
八、高效液相色谱的应用
高效液相色谱法的应用非常广泛，目前，HPLC在有机化学、生化、医学、药物临床、化工、食品卫生、环保监测、商检和法检等方面都有广泛的用途，而在生物和高分子试样的分离和分析中更是有明显优势。?高效液相色谱在生物领域中广泛用于下列产物的分离和鉴定：⑴氨基酸及其衍生物；⑵有机酸；⑶甾体化合物；⑷生物硷；⑸抗菌素；⑹糖类；⑺卟啉；⑻核酸及其降解产物；⑼蛋白质、酶和多肽；⑽脂类等。 3 \- |

1. 作为人工合成药物的精制手段，用于除去少量杂质，特别是那些异构体的分离。值得提出的是，药物中R-型和S-型的光学异构体具有不同的生理作用。为了研究药物的作用机制，需要拆分光学异构体(即对映体)，这是很困难的工作，而高效液相色谱在这方面显示了独特的长处。利用不同类型的手性固定相与对映体能生成稳定性不同的非对映异构体，从而达到分离的目的。# j& Z+ t( |) @! Q# P  i/ B/ a( h9 l) u1 }
2. 从一些复杂的混合物中排除干扰物质，并分析其中微量成分。0 Q. T$ ^) Q- d& _
3. 中草药有效成分的制备和分析。9 o* g* h/ J6 T# `; c
4. 环境监测和污染物的分析。这在环境污染日益严重的今天是非常重要的。
5. 食品中营养成分和物质的分析。高效液相色谱为食品成分的分析和定量提供了迅速可靠的途径，如定量分析食品中蛋白质、脂肪、碳水化合物和维生素等含量来确定食品的营养价值和品质。我国高效液相色谱技术在食品卫生领域中的应用始于20世纪70年代末，20世纪90年代后期，国家标准中开始将HPLC法列为检测食品中的营养成分、添加剂、有害物质的等的国标方法。
6. 手性分离技术目前已成为高效液相色谱十分重要和热门的应用领域。

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