主题：【第三届原创参赛】类人胶原蛋白的结构及纯化方法

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xuru560

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发表于：2010/11/30 11:08:43 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

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1 胶原蛋白的结构

胶原蛋白的基本结构单元是原胶原，每个原胶原分子由三条a-肽链组成，a-肽链自身为a螺旋结构，三条a-肽链则以平行、右手螺旋形式缠绕成“草绳状”三股螺旋结构。肽链中每三个氨基酸残基中就有一个要经过此三股螺旋中央区，而此处空间十分狭窄，只有甘氨酸适合于此位置，由此可解释其氨基酸组成中每隔两个氨基酸残基出现一个甘氨酸的特点。而且三条a-肽链是交错排列的，因而使三条a-肽链中的Gly、X、Y残基位于同一水平上。重复的Gly-X-Y序列使a-肽链卷曲为不同于a螺旋的左手螺旋。三股这样的螺旋再相互盘绕成右手超螺旋。这种结构的形成由Gly及Pro的重复存在所决定的, 即前述“胶原域”。链间氢键主要是在一条链的三联体（Gly-X-Y）中Gly的酰胺氢与另一条链的相邻三联体X位的羰基氧之间形成的，此外羟脯氨酸的羟基也参与了链间氢键的形成。链间的共价交联键主要是在赖氨酸残基或羟赖氨酸残基的侧链间形成的。因胶原分子氨基酸组成中缺乏半胱氨酸，不可能像角蛋白那样以二硫键相联，而是通过组氨酸与赖氨酸间的共价交联，一般发生在胶原分子的C-或N-末端之间。

2、胶原蛋白的纯化方法

在进行任何一种蛋白质纯化工艺设计之前,都需要我们尽可能多地先对目标蛋白和其中杂质的性质、提纯的体系进行了解。如目标蛋白质的相对分子质量、等电点、疏水性、带电性、碳氢链或自由巯基存在情况等。另外还需对影响目标蛋白活性的因素有了解,如温度、pH、有机溶剂、蛋白变性剂、重金属离子、机械剪切力等,以保证纯化后的蛋白活性。前人总结归纳和分析了200个已成功地提纯蛋白质的中试工艺,结果表明,纯化步骤平均为4 步,这4 步除柱层析技术外,还包括超滤和超离心等技术。一般中试纯化工艺大体由三部分组成: (1) 粗提; (2) 纯化;(3) 精制。

2.1 粗提

类人Ⅰ型胶原蛋白的粗分离:发酵液离心收集菌体,用蒸馏水洗3次,以质液比1∶3(质量比)把菌体悬浮在细胞破碎缓冲液(1 mmol/L EDTA,5 mmol/L Tris)中,超声破碎15 m in。破碎液于18℃,5 000 r/min离心1 h,收集上清液。上清液用硫酸铵分级沉淀,收取15%～65%饱和度的蛋白沉淀溶于20 mmol/L Tris2HCl(pH值为8.0)的缓冲液,用截留分子质量为30 ku的超滤膜包进行脱盐、

浓缩。

类人Ⅱ型胶原蛋白的粗分离:取发酵液于18℃恒温离心(5000r/min)1h。收集菌体后，水洗3遍。按1∶12(w/v)加水，混匀.高压匀浆破碎，破碎液于18℃,5 000 r/min离心1 h,收集上清液，向上清液中加入4%氯化钠, 用6mol/L盐酸调节溶液pH。待溶液沉淀完全后，除去沉淀上清液以截留分子量为3 0 ku的超滤膜进行脱盐，浓缩。

2.2纯化

经粗分离的上清液在不同pH值条件下分别过DEAE52(Φ2 cm×24 cm)柱和CM52(Φ2 cm×24 cm)柱,比较阴、阳离子交换层析,并选取pH为6.0。

2.3 精制

经离子交换层析的样品再过SephadexG2100(Φ10×100 cm)柱,用20 mmol/LTris2HCl(pH值为7.5)缓冲液作为洗脱液。

3电泳结果

经凝胶过滤层析得到的胶原蛋白为经凝胶过滤层析后得到的类人胶原蛋白为无色液体，经SDS-PAGE并以考马斯亮蓝染色后得单一条带，且两种蛋白的分子量在97ku左右。

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