2. DEAE 柱层析法
DEAE 纤维素的处理
(1) 浸泡:取 DE-23 100g,加蒸馏水浸泡过夜,弃上清,加蒸馏水缓慢搅匀,浸泡 3 小时后,弃上清,加蒸馏水,如此反复洗泡 8 次,尽量弃去其中的碎末。最后,弃上清加少量蒸馏水,搅匀成糊状。
(2) 碱处理:将糊状物移入玻璃漏斗中,抽滤干后,倒入烧杯中,加 0.5mol/LNaOH 1500mL,轻轻的搅匀,置室温 40~60min,每 10min 搅拌 1 次。倾去上清液,再移入玻璃漏斗中,反复用蒸馏水洗滤至中性。
(3) 酸处理:碱处理后倒入烧杯中,加入 0.5mol/L HCl 1500mL,轻轻的搅匀,置室温 40~50min,每 10min 搅匀一次,弃上清后移入玻璃漏斗中,加蒸馏水反复滤洗至中性。重复碱处理。
(4) 泡洗:用蒸馏水浸泡 2d,期间换水 5 次。
(5) 平衡:用 0.0175 mol/L,pH6.4 磷酸盐缓冲液浸泡,每 15min 换液 1 次,直至洗出液的 pH 为 6.4 为止,可准备上柱。
3. 免疫亲和层析法
CNBr 活化的琼脂糖颗粒的处理主要依照 Amersham Biosciences 公司的说明书进行。
(1) 溶胀:称取 10gCNBr-Sepharose CL-4B 干粉慢慢倒入装有一定 1mmol/L
HCl 的洁净烧杯中,在 4℃溶胀 15min。
(2) 洗涤:在 G3 烧结玻璃漏斗上,用大约 2000mL 1mmol/L 的 HCl 反复洗
涤溶胀的 CNBr-Sepharose CL-4B。
(3) 交联缓冲液:0.1mol/L,pH8.3 的 NaHCO3 溶液,含 0.5mol/L 的 NaCl。
(4) 封闭缓冲液:1mol/L,pH8.0 的乙醇胺溶液。
(5) 醋酸缓冲液:pH4.0,0.1mol/L,含 0.5mol/L NaCl。
(6) Tris-HCl 缓冲液:pH8.0,0.1mol/L,含 0.5mol/L NaCl。
3.2.3.2 抗体鉴定
1. 免疫扩散法
15g/L 琼脂凝胶:100mL,pH7.1 的磷酸盐缓冲液加到 1.5g 的琼脂内,水浴加温,搅拌,使琼脂完全溶解,趁热用纱布过滤,待溶液冷却到 65℃左右时,加入0.1g 叠氮钠(NaN3),使其于溶液中的浓度为 0.1%。