13 问:制备纯化蛋白、多肽,耗用流动相惊人,请问这些用过的流动相(乙腈,甲醇)可以重蒸使用吗?
答:
流动相用一般减压方法重蒸后,往往会形成有机溶剂和水会共沸,另外,由于减压蒸馏属于单次平衡,往往得不到100%纯度的溶剂,这会使溶剂的配置有一定困难,从而使色谱的重现性和分离度会发生一定的变化。如果要求不是很高的话,一般可以分析重蒸后馏分中的各组分含量,计算后再使用。
要通过重蒸得到纯物质是极其困难的,必须采用精馏塔多级蒸发,单就设备投资和能耗来讲,实验室规模或生产规模的废液回收处理已经是得不偿失。其实,我们没有必要得到纯的物质。
14 问:反相色谱分离纯化后,怎样除去流动相产品中的TFA和乙腈或其他杂质?
答:
TFA是反相色谱分离中常用的添加剂。可以用冻干的办法去除,国外许多文献是这样报道的。还可以试试离子交换、凝胶层析、甚至透析和超滤,其中,离子交换层析效果比较好,还可以起到浓缩样品的作用。
首先,冻干的办法应该可以几乎彻底地除去TFA和乙腈,药物实验前最好先检测一下冻干品中的残留量,只要不超过允许范围,这种办法是最最简单、有效的。
其次,如果你的药物的分装量不大的话(<100ug),建议你用离子交换层析,最好装一个小一点儿的柱子,让含盐洗脱峰的蛋白浓度达10mg/ml以上,稀释后完全符合试验要求。如果用分子筛,考虑稀释,最好也先过一个离子交换。此外可以试试疏水层析。如果产品是碱的话,可能会形成TFA盐,这样通过上述方法就无法除去。一般可以用碱水洗,然后将产品萃取出来。或者在里面加入一定量的盐酸,再干燥后形成盐酸盐。
15 问:同一种填料的分析柱、制备柱按线形放大公式套,分离度会不会变化?
答:
一般会有一定的变化,原因有以下几点
(1) 制备柱的装填是否均匀,如不均匀则可能产生涡流扩散使各个组分的经过通道的直径不同、阻力不一样,停留时间不同,色谱峰可能变宽。
(2) 如果样品在流动相中溶解度小,在制备色谱上会有不同的峰展宽。
(3)如果样品在分析柱上有展宽或拖尾的现象,放大到制备柱上后峰的展宽和拖尾经常会非常严重,导致分离失败。
16 问:制备色谱柱如何测柱效?
答:
可以选择几种物质,苯,甲苯,萘、蒽等的衍生物上柱,流动相一般用65-80%的甲醇/水,测定后根据保留时间计算塔板数。由于制备色谱的管路死体积一般比较大,很难得到和供应商相同的柱效。建议在制备柱开始使用时在自己的色谱上测一下柱效,然后定期检测柱效进行以进行比较。
17 问:反相色谱分离后,如何快速从流动相中得到产品?
答:
可以考虑先在低温下,减压旋蒸除去其中的有机溶剂,然后用萃取的方法(如乙醚、氯仿萃取等)把产品萃取出来,然后再低温再旋蒸,这样,就可以不将温度升得很高而得到产品。
如果要直接蒸掉流动相,水泵的真空度要注意(要检查气密性),否则蒸水会很慢。一般比较好的泵在60-70度即可蒸掉水,如果泵的真空度不好,可能需要80-90度才行,这样容易暴沸导致样品损失。另为,温度太高可能引起物质变性。