主题：【讨论】关于皮革奶检测的一点小想法

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从牛奶中分离酪蛋白和乳糖
一、引言
牛奶中主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/l。酪蛋白在乳中是以酪蛋白酸钙-磷酸钙复合体胶粒存在，
胶粒直径约为20～800纳米，平均为100纳米。在酸或凝乳酶的作用下酪蛋白会沉淀，加工后可制得干酪或干酪素。本实验利用加酸，当达到酪蛋白等电点PH=4.7时，酪蛋白沉淀。脱脂乳中除去酪蛋白后剩下的液体为乳清，在乳清中含有乳白蛋白和乳球蛋白，还有溶解状态的乳糖，乳中糖类的99.8%以上是乳糖，可通过浓缩、结晶制取乳糖。
二、实验材料和试剂
脱脂乳或脱脂奶粉。
醋酸-醋酸钠缓冲溶液（PH=4.7），95%乙醇，乙醚，碳酸钙粉末，苯肼试剂。
三、实验步骤
1. 从牛奶中分离酪蛋白
在烧杯中加入2g脱脂奶粉，再加入40ml40℃，PH=4.7的醋酸-醋酸钠缓冲溶液40ml，
用PH精密试纸检验液体的PH值。静置冷却至室温，倾去上层清液（留作分离乳糖用），剩下的悬浮液分别装入两支离心试管中，用转速为2000转/分离心分离3～5分钟，倾出上层清液，（合并于上一清液中），得酪蛋白粗品。于离心管中加入5ml蒸馏水，用玻棒充分搅拌，洗涤除去其中的水溶性杂质（如乳清蛋白，乳糖以及残留的缓冲溶液），离心后弃去上层液，再用蒸馏水洗一次。于试管中加入5ml95%乙醇，充分搅拌，离心后弃去乙醇溶液，用乙醇洗涤主要是除去磷脂类物质。最后再用5ml乙醚以同样方法洗涤，以除去脂肪类物质。将酪蛋白沉淀物凉干，称重、并计算得率。
2. 从牛奶中分离乳糖
在除去酪蛋白的乳清中，加入1.5g CaCO3粉末，搅拌均匀后加热至沸。加CaCO3的目的一方面是中和溶液的酸性，防止加热时乳糖水解，另方面又能使乳白蛋白沉淀。过滤除去沉淀，在滤液中加入1～2粒沸石，加热浓缩至3～5ml，加入10ml 95%乙醇（注意离开火焰）和少量活性炭，搅拌均匀后在水浴上加热至沸腾，趁热过滤，滤液必须澄清。加塞放置过夜，乳糖结晶析出，抽滤，用95%乙醇洗涤产品。
3. 乳糖成脎试验
取自制乳糖溶于少量水中，浓度约为5%，在试管中加入1ml乳糖溶液，1ml苯肼试剂①，摇匀，试管口用棉花塞住，在沸水浴中加热，并不时振摇，加热10～15分钟后，取出放置冷却，乳糖脎成结晶析出。取少量乳糖脎在显微镜下观察其结晶形态，可证实为乳糖。
①苯阱试剂有毒，小心使用，勿触及皮肤，如触及皮肤先用稀醋酸洗，再用水洗。

关于蛋白质的分离、纯化：
一般程序可分为以下几个步骤：
（一）材料的预处理及细胞破碎
分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有：
1. 机械破碎法
这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。
2. 渗透破碎法
这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。
3. 反复冻融法
生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。
4. 超声波法
使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。
5. 酶法
如用溶菌酶破坏微生物细胞等。
(二) 蛋白质的抽提
通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。
（三）蛋白质粗制品的获得
选用适当的方法将所要的蛋白质与其它杂蛋白分离开来。比较方便的有效方法是根据蛋白质溶解度的差异进行的分离。常用的有下列几种方法：
1. 等电点沉淀法
不同蛋白质的等电点不同，可用等电点沉淀法使它们相互分离。
2. 盐析法
不同蛋白质盐析所需要的盐饱和度不同，所以可通过调节盐浓度将目的蛋白沉淀析出。被盐析沉淀下来的蛋白质仍保持其天然性质，并能再度溶解而不变性。
3. 有机溶剂沉淀法
中性有机溶剂如乙醇、丙酮，它们的介电常数比水低。能使大多数球状蛋白质在水溶液中的溶解度降低，进而从溶液中沉淀出来，因此可用来沉淀蛋白质。此外，有机溶剂会破坏蛋白质表面的水化层，促使蛋白质分子变得不稳定而析出。由于有机溶剂会使蛋白质变性，使用该法时，要注意在低温下操作，选择合适的有机溶剂浓度。
（四）样品的进一步分离纯化
用等电点沉淀法、盐析法所得到的蛋白质一般含有其他蛋白质杂质，须进一步分离提纯才能得到有一定纯度的样品。常用的纯化方法有：凝胶过滤层析、离子交换纤维素层析、亲和层析等等。有时还需要这几种方法联合使用才能得到较高纯度的蛋白质样品。

看来检测方法是有眉目了呀！

皮革的水解产物主要是氨基酸、明胶等，明胶其实是多种氨基酸，蛋白质就是多种氨基酸组成的。本身对人无害，有害物应该是皮革鞣制过程的污染物。

原文由 儒雅凤(liwei7893) 发表:
皮革的水解产物主要是氨基酸、明胶等，明胶其实是多种氨基酸，蛋白质就是多种氨基酸组成的。本身对人无害，有害物应该是皮革鞣制过程的污染物。

我听说用垃圾里面捡来的皮鞋做皮革水解物，可怕的是已经形成产业链，谢谢儒雅凤的资料

皮革中胶原蛋白水解后，含有大量羟脯氨酸，牛奶中蛋白不含有这个东西，检测羟脯氨酸就可以知道是不是皮革奶了吧。

如果是用皮革‘鞣革’工艺，包括鞣制、染色等中产生的下脚料，就可能含有一些重金属。
应该可以通过三价铬和六价铬含量的检测来判断

农业部文件有附的检测方法。如下：
1．三聚氰胺：可采用快速法进行初步筛选，快速方法的检出限不高于0.05mg/kg。检测结果高于0.05mg/kg的样品采用《原料乳与乳制品中三聚氰胺检测方法》（GB/T 22388-2008）第二法或第三法进行确证。上报的检测结果为具体检测值。依据《卫生部、工业和信息化部、农业部、国家工商行政管理总局、国家质检总局公告》（2008年第25号）进行判定。
2．皮革水解蛋白：依据《乳与乳制品中皮革水解蛋白鉴定－L(－)－羟脯氨酸含量测定》（卫生部指定方法）。超出方法检出限即判定为不合格。
3．碱类物质：依据《乳与乳制品卫生标准的分析方法》（GB/T 5009.46-2003）进行检测，检出即判定为不合格。
4．黄曲霉毒素M1：可采用快速法进行初步筛选，快速方法的检出限不高于0.1µg/kg。检测结果高于0.1µg/kg的样品采用《食品安全国家标准 乳和乳制品中黄曲霉毒素M1的测定》（GB 5413.37-2010）第一法或第二法进行确证。上报的检测结果为具体检测值。依据《食品安全国家标准 生乳》（GB 19301-2010）进行判定。
5．铅：依据《食品安全国家标准 食品中铅的测定》（GB 5009.12-2010）进行检测。依据《食品安全国家标准 生乳》（GB 19301-2010）进行判定。

如果说皮革制品中的重金属会引入，那奶粉的重金属检测含量不就不合格了吗？

直接检测L-羟脯氨酸即可。牛奶蛋白中基本上不含有该物质，而动物胶原蛋白中则有。检测方法很多，分光光度法、LC-MS/MS以及LC法。相比较分光光度法，经过LC分离可以降低其它物质的干扰，其中LC法须对样品进行衍生化以后使用UV进行检测。
衍生试剂：2,4-二硝基氟苯，OPA/FITC等。