主题：【分享】欧盟拟修订多种作物中唑菌胺酯的残留限量

日本厚生省发布的检测方法：

ピラクロストロビン試験法（農産物）

１．分析対象化合物
　ピラクロストロビン

２．装置
　紫外分光光度型検出器付き高速液体クロマトグラフ（HPLC-UV）
　液体クロマトグラフ・質量分析計（LC/MS）

３．試薬、試液
　次に示すもの以外は、総則の３に示すものを用いる。

ピ	ラクロストロビン標準品　本品はピラクロストロビン98％以上を含み、融点は60～65℃である。

４．試験溶液の調製
１）抽出
(1)　穀類、豆類及び種実類の場合
　試料10.0ｇに水20 mLを加え、2時間放置する。これにメタノール100 mLを加え、ホモジナイズした後、吸引ろ過する。ろ紙上の残留物に、メタノール50 mLを加えてホモジナイズし、上記と同様にろ過する。得られたろ液を合わせて、40℃以下で約20 mLまで濃縮する。これに５％塩化ナトリウム溶液100 mLを加え、ｎ-ヘキサン100 mL及び50 mLで２回振とう抽出する。抽出液に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水し、無水硫酸ナトリウムをろ別した後、ろ液を40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。
　この残留物にｎ-ヘキサン30 mLを加え、ｎ-ヘキサン飽和アセトニトリル30 mLずつで２回振とう抽出する。アセトニトリル層を40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物にアセトン及びｎ-ヘキサン（１：19）混液５mLを加えて溶かす。

(2)　果実、野菜及びハーブの場合
　試料20.0ｇに、メタノール100 mLを加え、ホモジナイズした後、吸引ろ過する。ろ紙上の残留物に、メタノール50 mLを加えてホモジナイズし、上記と同様にろ過する。得られたろ液を合わせて、40℃以下で約20 mLまで濃縮する。これに５％塩化ナトリウム溶液200 mLを加え、ｎ-ヘキサン100 mL及び50 mLで２回振とう抽出する。抽出液に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水し、無水硫酸ナトリウムをろ別した後、ろ液を40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物にアセトン及びｎ-ヘキサン（１：19）混液５mLを加えて溶かす。

２）精製
(1)　シリカゲルカラムクロマトグラフィー
　クロマトグラフ管（内径15 mm）に、カラムクロマトグラフィー用シリカゲル（粒径63～200μm）５ｇをｎ-ヘキサンに懸濁させて充てんし、無水硫酸ナトリウム５ｇを積層する。このカラムに、１）で得られた溶液を注入した後、アセトン及びｎ-ヘキサン（１：19）混液45 mLを注入し、流出液は捨てる。次いでアセトン及びｎ-ヘキサン（３：17）混液50 mLを注入し、溶出液を40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物にアセトン及びｎ-ヘキサン（１：19）混液３mLを加えて溶かす。

(2)　エチレンジアミン-N-プロピルシリル化シリカゲルクロマトグラフィー
　エチレンジアミン-N-プロピルシリル化シリカゲルミニカラム（500 mg）にアセトン、ｎ-ヘキサン及びアセトン及びｎ-ヘキサン（１：19）混液各10 mLを順次注入し、各流出液は捨てる。このカラムに(1)で得られた溶液を注入した後、アセトン及びｎ-ヘキサン（１：19）混液12 mLを注入し、溶出液を40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物をアセトニトリル及び水（３：２）混液に溶解し、穀類、豆類及び種実類の場合は正確に４mL、果実、野菜及びハーブの場合は正確に８mLとしたものを、孔径0.45μmのメンブランフィルターを用いてろ過し、試験溶液とする。

５．検量線の作成
　ピラクロストロビン標準品の0.025～0.5 mg/Lアセトニトリル及び水（３：２）混液溶液を数点調製し、それぞれ20μLをHPLCに注入し、ピーク高法又はピーク面積法で検量線を作成する。

６．定量
　試験溶液20μLをHPLCに注入し、５の検量線でピラクロストロビンの含量を求める。

７．確認試験
　LC/MSにより確認する。

８．測定条件
１）HPLC
　検出器：UV（波長275 nm）

カ	ラム：トリアコンチルシリル化シリカゲル（粒径５μm）、内径4.6 mm、長さ250 mm

　カラム温度：40℃
　移動相：アセトニトリル、水及びメタノール（11：８：１）混液
　保持時間の目安：21分

２）LC/MS

カ	ラム：オクタデシルシリル化シリカゲル（粒径５μm）、内径２～2.1 mm、長さ150 mm

　カラム温度：40℃

移動相：	アセトニトリル及び0.01%ギ酸溶液混液（１：１）から（３：２）までの濃度勾配を20分間で行い、さらに（９：１）で５分間送液する。

　イオン化モード：ESI（＋）
　主なイオン（m/z）：388
　注入量：２μL
　保持時間の目安：19分

９．定量限界
　0.01 mg/kg

１０．留意事項
１）試験法の概要
　ピラクロストロビンを試料からメタノールで抽出し、ｎ-ヘキサンに転溶する。果実、野菜及びハーブはそのまま、穀類、豆類及び種実類の場合はアセトニトリル/ヘキサン分配で脱脂した後、シリカゲルカラム及びエチレンジアミン-N-プロピルシリル化シリカゲルミニカラムにより精製し、HPLC-UVで測定、LC/MSで確認する方法である。

２）注意点

(1)	HPLC分析において、試料由来の妨害成分を除去できない場合は、LC/MSを用いて測定を行う。
(2)	エチレンジアミン-N-プロピルシリル化シリカゲルミニカラムから妨害成分が溶出するため、あらかじめ、アセトン、ｎ-ヘキサン及びアセトン及びｎ-ヘキサン（１：19）混液各10 mLで洗浄して使用する。
(3)	試料によって不溶物が残ることから、これを除去する目的でメンブランフィルターを使用する。

１１．参考文献
　なし

１２．類型
　C

ピラクロストロビン試験法（畜産物）

１．分析対象化合物
　ピラクロストロビン

２．装置
　紫外分光光度型検出器付き高速液体クロマトグラフ（HPLC-UV）
　液体クロマトグラフ・質量分析計（LC/MS）

３．試薬、試液
　次に示すもの以外は、総則の３に示すものを用いる。

ピ	ラクロストロビン標準品　本品はピラクロストロビン98％以上を含み、融点は60～65℃である。

４．試験溶液の調製
１）抽出
　筋肉、脂肪、肝臓、腎臓、その他の食用部分、卵及び乳の場合は、5.00ｇを量り採る。乳の場合は、よく混合して均一化した後、その5.00ｇを量り採る。
　これにアセトニトリル50 mL、アセトニトリル飽和ｎ-ヘキサン50 mL及び無水硫酸ナトリウム10ｇを加え、ホモジナイズした後、毎分3,000回転で５分間遠心分離を行う。アセトニトリル層を採り、ヘキサン層及び残留物にアセトニトリル50 mLを加えてホモジナイズし、上記と同様に遠心分離を行う。得られたアセトニトリル層を先のアセトニトリル層に合わせ、40℃以下で濃縮し溶媒を除去する。これに５％塩化ナトリウム溶液100 mLを加え、ｎ-ヘキサン100 mL及び50 mLで２回振とう抽出する。抽出液に無水硫酸ナトリウムを加えて脱水し、無水硫酸ナトリウムをろ別した後、ろ液を40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物にアセトン及びｎ-ヘキサン（１：19）混液５mLを加えて溶かす。

２）精製
(1)　シリカゲルカラムクロマトグラフィー
　クロマトグラフ管（内径15 mm）に、カラムクロマトグラフィー用シリカゲル（粒径63～200μm）５ｇをｎ-ヘキサンに懸濁させて充てんし、無水硫酸ナトリウム５ｇを積層する。このカラムに、１）で得られた溶液を注入した後、アセトン及びｎ-ヘキサン（１：19）混液45 mLを注入し、流出液は捨てる。次いでアセトン及びｎ-ヘキサン（３：17）混液50 mLを注入し、溶出液を40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物にアセトン及びｎ-ヘキサン（１：19）混液３mLを加えて溶かす。

(2)　エチレンジアミン-N-プロピルシリル化シリカゲルクロマトグラフィー
　エチレンジアミン-N-プロピルシリル化シリカゲルミニカラム（500 mg）にアセトン、ｎ-ヘキサン及びアセトン及びｎ-ヘキサン（１：19）混液各10 mLを順次注入し、流出液は捨てる。このカラムに(1)で得られた溶液を注入した後、アセトン及びｎ-ヘキサン（１：19）混液12 mLを注入し、溶出液を40℃以下で濃縮し、溶媒を除去する。この残留物をアセトニトリル及び水（３：２）混液に溶解し、正確に２mLとしたものを孔径0.45μmのメンブランフィルターを用いてろ過し、試験溶液とする。

５．検量線の作成
　ピラクロストロビン標準品の0.025～0.5 mg/Lアセトニトリル及び水（３：２）混液溶液を数点調製し、それぞれ20μLをHPLCに注入し、ピーク高法又はピーク面積法で検量線を作成する。

６．定量
　試験溶液20μLをHPLCに注入し、５の検量線でピラクロストロビンの含量を求める。

７．確認試験
　LC/MSにより確認する。

８．測定条件
１）HPLC
　検出器：UV（波長275 nm）

カ	ラム：トリアコンチルシリル化シリカゲル（粒径５μm）、内径4.6 mm、長さ250 mm

　カラム温度：40℃

移	動相：アセトニトリル、水及びメタノール（11：８：１）混液

　保持時間の目安：21分

２）LC/MS

カ	ラム：オクタデシルシリル化シリカゲル（粒径５μm）、内径2.1 mm、長さ150 mm

　カラム温度：40℃

移動相：	アセトニトリル及び0.01%ギ酸溶液混液（１：１）から（３：２）までの濃度勾配を20分間で行い、さらに（９：１）で５分間送液する。

　イオン化モード：ESI（＋）
　主なイオン（m/z）：388
　注入量：２μL
　保持時間の目安：19分

９．定量限界
　0.01 mg/kg

１０．留意事項
１）試験法の概要
　ピラクロストロビンを試料からアセトニトリルで抽出すると同時にｎ-ヘキサン洗浄し、ｎ-ヘキサンに転溶した後、シリカゲルカラム及びエチレンジアミン-N-プロピルシリル化シリカゲルミニカラムにより精製し、HPLC-UVで測定、LC/MSで確認する方法である。

２）注意点

(1)	HPLC分析において、試料由来の妨害成分を除去できない場合は、LC/MSを用いて測定を行う。
(2)	エチレンジアミン-N-プロピルシリル化シリカゲルミニカラムから妨害成分が溶出するため、あらかじめ、アセトン、ｎ-ヘキサン及びアセトン及びｎ-ヘキサン（１：19）混液各10 mLで洗浄して使用する。
(3)	試料によって不溶物が残ることから、これを除去する目的でメンブランフィルターを使用する。

１１．参考文献
　なし

１２．類型
　C