4.7 结果判断
4.7.1 定性测定
定性测定的结果判断是对受检标本中是否含有待测抗原或抗体作出 "有"或"无"的简单回答,分别用"
阳性"、"阴性"表示。"阳性"表示该标本在该测定系统中有反应。"阴性"则为无反应。用定性判断法也可得
到半定量结果,即用滴度来表示反应的强度,其实质仍是一个定性试验。在这种半定量测定中,将标本作
一系列稀释后进行试验,呈阳性反应的最高稀释度即为滴度。根据滴度的高低,可以判断标本反应性的强
弱,这比观察不稀释标本呈色的深浅判断为强阳性、弱阳性更具定量意义。
在间接法和夹心法 ELSIA 中,阳性孔呈色深于阴性孔。在竞争法ELISA 中则相反,阴性孔呈色深于
阳性孔。两类反应的结果判断方法不同,分述于下。
(1) 间接法和夹心法
这类反应的定性结果可以用肉眼判断。目视标本也无色或近于无色者判为阴性,显色清晰者为阳性。
但在 ELSIA 中,正常人血清反应后常可出现呈色的本底,此本底的深浅因试剂的组成和实验的条件不同而
异,因此实验中必须加测阴性对照。阴性对照的组成应为不含受检物的正常血清或类似物。在用肉眼判断
结果时,更宜用显色深于阴性对照作为标本阳性的指标。
目视法简捷明了,但颇具主观性。在条件许可下,应该用比色计测定吸光值,这样可以得到客观的数
据。先读出标本( sample,S)、阳性对照(P)、和阴性对照(N)的吸光值,然后进行计算。计算方法
有多种,大致可分为阳性判定值法和标本与阴性对照比值法两类。
a. 阳性判定值
阳性判定值(cut-off value)一般为阴性对照A 值加上一个特定的常数,以此作为判断结果阳性或阴性
的标准。
用此法判断结果要求实验条件十分恒定,试剂的制备必须标准化,阳性和阴性的对照品应符合一定的
规格,须配用精密的仪器,并严格按规定操作。阳性判定值公式中的常数是在这特定的系统中通过对大量
标本的实验检测而得到的。现举某种检测 HBsAg 的试剂盒为例。试剂盒中的阴性对照品为不含HBsAg 的
复钙人血浆,阳性对照品HBsAg 的含量标明为P=9±2ng /ml。每次试验设2 个阳性对照和3 个阴性对照。
测得A 值后,先计算阴性对照A 值的平均数(NC X )和阳性对照A 值的平均数(PCX),两个平均数的
差(P-N)必须大于一个特定的数值(例0.400),试验才有效。3 个阴性对照 A 值均应≥0.5×NCX,并≤1.5
×NCX,如其中之一超出此范围,则弃去,而已另两个阴性对照重新计算NCX;如有两个阴性对照A 值超
出以上范围,则该次实验无效。阳性判定值按下式计算:
阳性判定值=NCX+0.05
标本 A 值>阳性判定值的为阳性,小于阳性判定值的为阴性。应注意的是,式中0.05 为该试剂盒的
常数,只适合于该特定条件下,而不是对各种试剂均可通用。
根据以上叙述可以看出,在这种方法中阴性对照和阳性对照也起到试验的质控作用,试剂变质和操作
不当均会产生"试验无效"的后果。
b.标本/阴性对照比值
在实验条件(包括试剂)较难保证恒定的情况下,这种判断法较为合适。在得出标本( S)和阴性对
照(N)的A 值后,计算S/N 值。也有写作P/N 的,这里的P 不代表阳性(positive),而是病人(pati ent)
的缩写,不应误解。为避免混淆,更宜用S/N 表示。在早期的间接法ELISA 中,有些作者定出S/N 为阳性
标准,现多为各种测定所沿用。实际上每一测定系统应该用实验求出各自的 S/N 的阈值。更应注意的是,
N 所代表的阴性对照是不含受检物质的人血清。有的试剂盒中所设阴性对照为不含蛋白质或蛋白质含量较
底的缓冲液,以致反应后产生的本底可能较正常人血清的本底低得多。因此,这类试剂盒规,如 N<0.05
(或其他数值),则按0.05 计算,否则将出现假阳性结果。
(2)竞争法
在竞争法 ELISA 中,阴性孔呈色深于阳性孔。阴性呈色的强度取决于反应中酶结合物的浓度和加入竞
争抑制物的量,一般调节阴性对照的吸光度在 1.0-1.5 之间,此时反应最为敏感。
竞争法 ELISA 不易用自视判断结果,因肉眼很难辨别弱阳性反应与阴性对照的显色差异,一般均用比
色计测定,读出S、P 和N 的吸光值。计算方法主要也有两种,即阳性判定值法和抑制率法。
a. 阳性判定值法
与间接法和夹心法中的阳性判定值法基本相同,但在计算公式中引入阳性对照 A 值,现举某种检测抗
HBc 的试剂盒为例。试剂盒中的阴性对照为不含抗HBc 的复钙人血浆,阳性对照中抗HBc 含量为125±1
00u/ml。每次试验设2 个阳性对照和3 个阴性对照。测得A 值后,先计算阴性对照A 值的平均值(NC X )
和阳性对照A 值的平均数(PCX),两个平均数的差(N-P)必须大于一个特定的数值(例如0.300),试验
才有效。3 个阴性对照 A 值均应小于2.000,而且应≥0.5×NCX 并≤1.5×NCX,如其中之一超出此范围,则
弃去,而以另2 个阴性对照重新计算×NCX;如有2 个阴性对照A 超出以上范围,则该次实验无效。阳性
判定值按下式计算:
阴性判定值=0.4×NCX+0.6×PCX
标本 A 值≤阳性判定值的反应为阳性,A>阳性判定值的反应为阴性。
b. 抑制率法
抑制率表示标本在竞争结合中标本对阴性反应显色的抑制程度,按下式计算:
抑制率(%)= (阴性对照A 值-标本A 值)×100%/阴性对照A 值
一般规定抑制率≥50%为阳性,<50%为阴性。