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主题：【分享】蛋白测定（FIB）标准操作规程(SOP)

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发表于：2011/04/22 16:56:07 楼主 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
原理：在确定量的血浆样本经过一定时间的加温后，加入试剂。加入试剂后，采用波长为660nm的光照射样本。凝血过程（纤维蛋白原转化为纤维蛋白）中血的浑浊度可以通过测量散射光光强度的改变来测定。从散射光光强度的测定，可以做出凝血曲线，通过PercentageDetection Method方法求得凝血时间。

一、仪器：
（一）型号：Sysmex CA—1500自动血液凝血分析仪
（二）分析和计算参数：
1．处理量：约120个测试/小时
2．所需样本量：10μl
3．检验时间：在最长检验时间之内测出结果，典型最长检验时间：100秒
4．重复性：CV≤4%
5. 计算参数：纤维蛋白原浓度（Fbg）

二、试剂及配套品：
（一）试剂：
1. 凝血酶试剂（Thrombin Reagent）
（1）商标：德灵（DADE BEHRING）
（2）包装规格：Pack for 10×1ml
（3）代码：B4233 G25 E0533 (961) W
（4）成分：
牛凝血酶冻干粉（lyophilized preparation of bovine thrombin）（近似100 NIH units/ml）
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2011/4/22 17:04:31 沙发 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊

（3）代码：B4234-25
（4）成分：
1）2.84×10­²M的巴比妥钠 (sodium barbital)
2）1.25×10­¹M 的氯化钠 (sodium chloride)
3) PH 7.35±0.1
3. 清洗液（Cleaning）
2%次氯酸钠溶液（自配）
（二）配套品：
1.标准血浆（Standard Human Plasma）
(1) 商标：德灵（DADE BEHRING）
(2) 代码：No. ORKL
2.校准质控血浆（Ci-Trol®）
(1) 商标：德灵（DADE BEHRING）
(2) 代码：Level 1, B4244-10
Level 2, B4244-20
Level 3, B4244-30
3.质控血浆（Control Plasma）
(1) 商标：太平洋（Pacific Hemostasis）
(2) 代码及规格：Level 1 (Normal), 100595 10×1ml
Level 2 (Abnormal), 100596 10×1ml
Level 3 (Abnormal), 100597 10×1ml

三、操作步骤：
（一） 开机：开机前，先打开连机的打印机。按下机器右边的POWER按钮。开机后机器进行自检，当屏幕上边显示“Ready”时可以进行试验。
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2011/4/22 17:08:19 板凳 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊

实验原理



蛋白质分子中所含酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质在280nm波长处有最大吸收值。在一定浓度范围内，蛋白质溶液的光吸收值（A280）与其含量成正比关系，可用作定量测定。紫外线吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速，简便，不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。因此，广泛应用在柱层析分离中蛋白质洗脱情况的检测。此法的缺点是：（1）对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定的误差；（2）若样品中核酸等吸收紫外线的物质，会出现较大的干扰。不同的蛋白质和核酸的紫外线吸收是不同的，即使经过校正，测定结果也还存在一定的误差。但是可作为初步定量的依据。该法可测定蛋白范围应在0.1~1.0mg /mL。

试剂和器材

一、标准和待测蛋白质溶液

1.标准蛋白溶液

结晶牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度配制成1mg/mL蛋白溶液。

2. 待测蛋白质溶液

人血清，使用前稀释100倍。

二、器材

试管1.5×15cm（×9），试管架，移液管1mL（×3）；2mL（×2）；5mL（×2）；分光光度计。

操作方法

一、制作标准曲线

取8支试管编号，按下表分别向每支试管加入各种试剂，摇匀。选用光程为1cm的石英比色杯，在280nm波长处分别测定各管溶液的A280值。以A280值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘制标准曲线。

                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                       
           

           

1

           

2

           

3

           

4

           

5

           

6

           

7

           

8

           

标准蛋白质溶液（mL）

           

0

           

0.5

           

1.0

           

1.5

           

2.0

           

2.5

           

3.0

           

4.0

           

蒸馏水（mL）

           

4.0

           

3.5

           

3.0

           

2.5

           

2.0

           

1.5

           

1.0

           

0

           

蛋白质浓度 (mg/mL)

           

0

           

0.125

           

0.250

           

0.375

           

0.500

           

0.625

           

0.750

           

1.00

           

A280

           

           

           

           

           

           

           

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2011/4/22 17:09:06 马扎 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
二、样品测定

取待测蛋白质溶液1mL，加入蒸馏水3mL，摇匀，按上述方法在280nm波长处测定光吸收值，并从标准曲线上查出待测蛋白质的浓度。

注意事项



由于各种蛋白质含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，显色的深浅往往随不同的蛋白质而变化。因而本测定法通常只适用于测定蛋白质的相对浓度（相对于标准蛋白质）。此外蛋白溶液中存在核酸或核苷酸时也会影响紫外吸收法测定蛋白质含量的准确性。
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2011/4/22 17:09:43 地毯 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊

实验原理



Folin—酚试剂法最早是由Lowry确定的测定蛋白质浓度的基本方法。以后在生物化学领域得到广泛的应用。此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin—酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这个方法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺点是费时较长，要严格控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。凡干扰双缩脲反应的基团，如 -CO-NH2,-CH2-NH2, CS-NH2以及Tris缓冲液、蔗糖、硫酸铵、巯基化合物均可干扰Folin—酚反应，而且对后者的影响还要大得多。此外，酚类、柠檬酸对此反应也有干扰作用。

Folin—酚试剂由甲试剂和乙试剂组成。甲试剂由碳酸钠，氢氧化钠，硫酸铜及酒石酸钾钠组成。蛋白质中的肽键在碱性条件下，与酒石酸钾钠铜盐溶液起作用，生成紫红色络合物。乙试剂是由磷钼酸和磷钨酸、硫酸、溴等组成。此试剂在碱性条件下，易被蛋白质中酪氨酸的酚基还原呈蓝色反应，其色泽深浅与蛋白质含量成正比。此法也适用于测定酪氨酸和色氨酸的含量。本法可测定范围是25—250μg蛋白质。

试剂和器材

一、试剂

Folin—酚试剂:

试剂甲：

1) 4%碳酸钠溶液

2) 0.2mol/L氢氧化钠溶液

3) 1%硫酸铜溶液

4) 2%酒石酸钾钠溶液。

临用前将（1）与（2）等体积配制碳酸钠—氢氧化钠溶液。（3）与（4）等体积配制成硫酸铜—酒石酸钾钠溶液。然后这两种试剂按50:1的比例配合，即成Folin—酚试剂甲。此试剂临用前配制，一天内有效。

试剂乙：

称钨酸钠（Na2WO2?2H2O）100g，钼酸钠（Na2MoO4?2H2O）25g置2000mL磨口回流装置内，加蒸馏水700mL，85%磷酸50mL和浓硫酸100mL。充分混匀，使其溶解。小火加热，回流10h（烧瓶内加小玻璃珠数颗，以防溶液溢出），再加入硫酸锂（LiSO4）150g，蒸馏水50mL及液溴数滴。在通风橱中开口煮沸15min，以除去多余的溴。冷却后定容至1000mL，过滤即成Folin—酚试剂乙贮存液，此液应为鲜黄色，不带任何绿色。置棕瓶中，可在冰箱长期保存。若此贮存液使用过久，颜色由黄变绿，可加几滴液溴，煮沸几分钟，恢复原色仍可继续使用。

试剂乙贮存液在使用前应确定其酸度。以之滴定标准氢氧化钠溶液（1mol/L左右），以酚酞为指示剂，当溶液颜色由红→紫红→紫灰→墨绿时即为滴定终点。该试剂的酸度应为2mol/L左右，将之稀释至相当于1mol/L酸度应用。
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2011/4/22 17:10:35 地板 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
二、标准和待测蛋白质溶液

1. 标准蛋白质溶液

结晶牛血清白蛋白或酪蛋白，预先经微量克氏定氮法测定蛋白质含量，根据其纯度配制成150μg/mL蛋白溶液

2. 待测蛋白质溶液

人血清，使用前稀释150倍。

三、器材

试管1.5×15cm（×6），试管架，移液管0.5mL（×2）；1mL（×2）；5mL（×1）；恒温水

浴；分光光度计。


操作方法

一、制作标准曲线

取7支试管，按下表平行操作：

                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                               
           

试管编号

试剂处理		           

1

           

2

           

3

           

4

           

5

           

6

           

7

           

标准蛋白质溶液（mL）		           

0

           

0.1

           

0.2

           

0.4

           

0.6

           

0.8

           

1.0

           

蒸馏水（mL）		           

1.0

           

0.9

           

0.8

           

0.6

           

0.4

           

0.2

           

0

           

Folin-酚甲试剂（mL）		           

5.0

           

5.0

           

5.0

           

5.0

           

5.0

           

5.0

           

5.0

           

摇匀，于20—25℃放置10min

           

Folin- 酚乙试剂（mL）

           

0.5

           

0.5

           

0.5

           

0.5

           

0.5

           

0.5

           

0.5

           

迅速摇匀，30℃（或室温20—25℃）水浴保温30min，以蒸馏水为空白，

           

在640nm处比色

           

A640

           

           

           

           

           

           

           



绘制标准曲线：以A640值为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。
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2011/4/22 17:11:03 6楼 管理 分享 倒序浏览 只看楼主 回复 私聊
二、未知样品蛋白质浓度测定

取2支试管，按下表平行操作：

                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                       
           

试管编号

试剂处理		           

空白管

           

×2

           

样品管

           

×2

           

血清稀释液 (mL)

           

0

           

0.2

           

蒸馏水 (mL)

           

1.0

           

0.8

           

Folin－酚甲试剂(mL)

           

5.0

           

5.0

           

摇匀，于20—25℃放置10min

           

Folin－酚乙试剂(mL)

           

0.5

           

0.5

           

迅速摇匀，30℃（或室温20—25℃）水浴保温30min，以蒸馏水为空白，在640nm处比色

           

A640

           

           



三、计算



注意事项

(1) Folin-酚乙试剂在酸性条件下较稳定，而Folin－酚甲试剂是在碱性条件下与蛋白质作用生成碱性的铜－蛋白质溶液。当Folin－酚乙试剂加入后，应迅速摇匀（加一管摇一管），使还原反应产生在磷钼酸－磷钨酸试剂被破坏之前。

(2) 血清稀释的倍数应使蛋白质含量在标准曲线范围之内，若超过此范围则需将血清酌情稀释。
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实验原理

考马斯亮蓝（Coomassie BrilliantBlue）法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。

考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰（lmax）的位置，由465nm变为 595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。研究发现，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。

考马斯亮蓝染色法的突出优点是：

（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。

（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。

（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。

此法的缺点是：

（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此考马斯亮蓝染色法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。

（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）等。

试剂与器材

一、试剂



考马斯亮蓝试剂：

考马斯亮蓝G―250 100mg溶于50mL 95%乙醇中，加入100mL 85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000mL。

二、标准和待测蛋白质溶液

1．标准蛋白质溶液

结晶牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度用0.15mol/L NaCl配制成1mg/mL蛋白溶液。

2．待测蛋白质溶液。

人血清，使用前用0.15mol/L NaCl稀释200倍。

三、器材

试管1.5×15cm（×6），试管架，移液管管0.5mL（×2）；1mL（×2）；5mL（×1）；恒温

水浴；分光光度计。

操作方法

一、制作标准曲线



取7支试管，按下表平行操作。

                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                                           
           

试管编号

           

0

           

1

           

2

           

3

           

4

           

5

           

6

           

标准蛋白溶液（mL）

           

0

           

0.01

           

0.02

           

0.03

           

0.04

           

0.05

           

0.06

           

0.15mol/L NaCl（mL）

           

0.1

           

0.09

           

0.08

           

0.07

           

0.06

           

0.05

           

0.04

           

考马斯亮蓝试剂（mL）

           

5mL
           

摇匀，1h内以0号管为空白对照，在595nm处比色

           

A595nm

            



绘制标准曲线：以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。



二、未知样品蛋白质浓度测定

测定方法同上，取合适的未知样品体积，使其测定值在标准曲线的直线范围内。根据所测定的A595nm值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度（mg/mL）。

注意事项

  • 在试剂加入后的5－20min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。
  • 测定中，蛋白－染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干净。
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