3.2试样制备
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无菌操作称取剪碎后的样品25g,置于装有225mL氯化钠胰蛋白胨稀释液的广口瓶中。若检测亚硫酸盐还原梭菌的芽胞,可75℃ 20min或煮沸保持10min热处理样品,之后以流水迅速冷却至室温后再称取。充分混匀后据样品污染情况做进一步的系列十倍梯度稀释。
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4.检验步骤与计数
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4.1菌落计数法
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适用于检查未经加工处理的生鲜食品及亚硫酸盐还原梭菌计数>10g(mL)的食品。
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4.1.1接种和培养
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4.1.1.1对每一份试样,选用适宜的三个连续稀释度的样液,分别用灭菌吸管吸取1 mL,一式双份地接种于每个灭菌的培养皿中。
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4.1.1.2 倾注约15 mL制备好的并于水浴箱保温至45℃的亚硫酸铁琼脂。从制备最初稀释液结束到倾注培养基于最后一个平皿所用的时间不应超过15min。仔细将接种物和培养基充分混匀,水平放置,使其凝固。
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4.1.1.3待混合物凝固后,在倾注10 mL同样的培养基于已凝固的培养基上作为隔层以防氧吸附,并防止细菌蔓延生长。
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4.1.1.4 待该隔层凝固后反转制备好的平板,于37±1℃厌氧培养24-48h。若对培养温度有特殊要求(如46℃),可依据情况进行培养。
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4.1.2计数
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4.1.2.1亚硫酸盐还原梭菌在亚硫酸铁琼脂上呈暗灰色或黑色菌落。37±1℃厌氧培养24h后,计数典型的菌落;若平板上无特征性菌落或菌落较小(<0.5mm),则需继续培养24h再计数;若48 h后的菌落增大以至相连,则以24 h的计数为准,反之则以48h为准。
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那些仅产生氢(而不是H2S)的厌氧菌生长时也可还原亚硫酸盐而导致培养基出现弥散的、非典型的普遍变黑,这种现象不应计数。
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4.1.2.2取特征性菌落(不少于5个)移种于疱肉培养基中,37±1℃厌氧培养24-72 h。待出现生长特征(培养液浑浊、产气、出现异味)后,按5条进行证实试验。对阳性结果进行计数。
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4.1.2.3读取带有10-100个黑色菌落的平皿,结果以相应稀释度的两个平板的菌落数平均值乘以相应稀释倍数来计算每克样品中亚硫酸盐还原梭菌数。结果报告如下:估计亚硫酸盐还原梭菌数/g(mL)。
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若相应测试试样的两个平板上均无特征性菌落,以<10/g(mL)报告