主题：转贴：[Mass原创]食品中黄曲霉毒素的测定方法

转自色谱网，作者：Mass

食品中黄曲霉毒素的测定，主要有TLC、ELISA、HPLC 等方法，TLC法灵敏度和重现性较差；ELISA法重现性差，易受样品基质干扰假阳性率高，仅能作为筛选方法。近年来，由于HPLC法具有灵敏度和准确度高、方法重现性好等优点，现已成为黄曲霉毒素分析的主要手段。HPLC法测定黄曲霉毒素，一般使用灵敏度和选择性较好的荧光检测器。但由于黄曲霉毒素的荧光强度会受溶剂影响，正相色谱中，B1和B2的荧光强度仅稍低一点，不需衍生化；而在常用的反相色谱中，B1和G1两种异构体荧光强度很弱，需进行衍生化，提高其荧光强度，灵敏度才能满足一般食品法规的限量。衍生化的方法一般有柱前和柱后两类， 柱前衍生一般使用三氟乙酸，柱后衍生有碘液、过溴化吡啶溴以及电化学和光化学等方法。近年来，很多标准方法利用免疫亲合柱净化，HPLC柱后衍生对花生和玉米等农产品和食品中黄曲霉的含量进行了分析，方法检出限能够达到1 μg/kg以下。

Q1。免疫亲和柱的填料是什么，它是怎样工作的，为什么要用它？

    免疫亲合柱对于欧们学化学的好像陌生了一点，不过你把它当成一种层析柱就行了。它的所谓填料就是固定了抗体的凝胶（黄曲霉毒素的柱子一般是单克隆抗体），基于抗原抗体反应进行工作，专一性很强，再加上另一种原理（反相或正相液相色谱）的分离，即使你把它当作确证方法也能说的过去。其实免疫亲和柱净化后的样品已经非常干净，直接加溴水也可在荧光分光光度计上进行测定，也是AOAC 991。31正式方法。现在还有一种普通霉菌毒素净化柱（不是免疫柱）要便宜一些，能做的霉菌毒素品种也多，但是专一性就差些。

Q2。Kobra cell可以在线产生溴，这对分析有什么作用？是可以提高灵敏度吗？如果是，溴是如何与黄曲霉素反应的？络合？氧化？还是别的什么？

    由欧以上的论述，应该说是提高反相HPLC分析中黄曲霉毒素B1、G1的灵敏度。反应原理欧还真的没研究，可能和柱后衍生类似（氧化？），考虑到进入精益求精的要求还是不乱猜了吧。

Q3。看到书上说黄曲霉素的毒性是KCN的10倍，是砒霜的68倍。晕啊。。。操作时有没有特别的个人防护措施？

这个阿胖讲得差不多了，方法也就是用次氯酸钠溶液泡器皿，当然最好不要自己称固体标样，那东东有静电，很容易飞出来，买溶液就行了。

要补充的1、就是没阿胖讲的那么可怕，对欧盟出口花生及制品的检测实验室都使用免疫亲和柱净化-HPLC—RF法确证，每年可能要做上万个样品。2、HPLC法的干扰比酶免方法不知道要小多少，有的HPLC筛选方法，提取后不净化就直接进样了，也很少有干扰。采用哪种方法主要是和要求有关，如果让洋人拿着鞭子在后面抽着干，肯定是要用HPLC法；如果就骗骗中国的官僚和老百姓，那就像啊胖说的，酶免法又省钱有省事，嘿嘿。。。。3、GB/T 5009的TLC法，净化方法很差，UV灯下看上去是一条亮带，满足国标20PPB的限量都很勉强，这一点你可看看旧贴http://www.sepu.net/dvbbs/dispbbs.asp?BoardID=5&replyID=47615&id=18220&skin=0欧论述的也差不多了。

1、AOAC方法简述

25g均匀样品，加入氯化钠5 g和125 mL甲醇：水（7+3），均质2min，过滤。取15 mL滤液加30 mL水，再次过滤后，取10 mL过免疫亲和柱，2×10 mL水洗柱，最后用1 mL甲醇洗脱黄曲霉毒素，用水定容至2 mL，供HPLC测定。
HPLC条件：

色谱柱：4.6×250 mm, 5 μm，C18；


流动相：甲醇-乙腈-水（1+1+3）；


流速：1.0 mL/min；                             


柱后衍生试剂：100 mg碘溶于2 mL甲醇，加水至200 mL。流速0.3 mL/min；


衍生化温度：70 ℃；


衍生化时间：55 s；


激发波长：360 nm；


发射波长：> 420 nm；



进样量：50 μL。

3. 方法技术指标：


免疫亲和柱净化，HPLC柱后衍生化的方法回收率



(1) 2000年AOAC协同试验结果


B1: 82- 109 %(添加水平：1.0- 5.0 ng/g)



B2: 77- 123 %(添加水平：0.2- 0.8 ng/g)



G1: 58- 93 %(添加水平：1.0- 5.0 ng/g)



G2: 62- 105 %(添加水平：0.2- 0.8 ng/g)



(2) 1991年AOAC协同试验结果



B1: 77- 90 %(添加水平：5.8- 17.5 ng/g)



B2: 55- 70 %(添加水平：0.83- 2.5 ng/g)



G1: 76- 98 %(添加水平：2.5- 7.5 ng/g)




G2: 36- 55 %(添加水平：0.83- 2.5 ng/g)

碘衍生化方法的反应温度要70 ℃，需要单独的柱温箱，还要一个打衍生剂的泵。故可以采用以下两种方法来代替碘溶液作柱后衍生

（1）过溴化吡啶溴（PBPB）衍生



色谱柱：4.6×250 mm, 5 μm，C18；



流动相：水-乙腈-甲醇（6+2+3）；



流速：1.00 mL/min；



衍生化溶液：25 mg PBPB (CAS: 39516-58-3)溶于500 mL水，室温下避光可保存5天；



衍生化溶液流速：0.30 mL/min；



衍生化反应管：55 cm × 0.5 mm id.;



衍生化反应温度：室温。



（2）电化学反应池衍生



色谱柱：4.6×250 mm, 5 μm，C18；



流动相：水-乙腈-甲醇（6+2+3），每升加350 μL HNO3 (5 mol/L)，同时溶解120 mg KBr；



衍生化反应池：Kobra cell; Rhone Diagnostics Technologies Ltd.，




衍生化操作电流：100 μA。