主题：【分享】老生粗谈之HPLC方法建立

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dahua1981

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发表于：2012/03/20 15:28:53 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

分析方法的建立步骤：
1.积累背景资料
经过十几年的发展，基于分析化学、药物化学、临床药理学以及毒理学以及毒理学的药物残留分析已经成为一门新兴学科，内容包括药物原形及代谢产物的含量测定、结构鉴定以及组织分布与代谢。
文献检索通常能显示适宜的分析方法，可通过查阅文献对以往分析方法进行比较和借鉴，了解与建立方法相关的背景资料，掌握样品的前处理、分离和检测方面的粗略信息，这对根据具体实验条件调整、改进或新建立符合要求的分析方法都十分重要。如针对新的药物或采用新技术全新的分析方法，可从具有相近结构或官能团化合物的分析方法中获得启发。
除掌握有关分析方法研究应用动态和存在的问题外，应尽可能全面了解以下内容：待测药物的理化性质，日极性、溶解性、稳定性、熔点或蒸汽压、波谱学性质等；体内代谢过程，包括代谢产物、组织分布、排泄途径和药动力学性质，药理毒理学等。
2.拟定HPLC条件
首先建立测定方法和线性范围，为后续工作提供分析手段，根据药物成分的理化性质特征确定选用何种检测器，最后根据干扰和使用情况逐步建立HPLC测定条件。
在色谱分析中，选择最佳的色谱条件是实现理想分离的关键，也是用计算机实现HPLC分析方法建立和优化的任务之一。如基质种类的选择，理想的液相色谱流动相溶剂应具有低粘度、与检测器兼容性好、易于得到纯品和低毒性等特征。对大多数药物而言，反向HPLC是常用的分离方法，操作方便，易获得尖锐峰型和良好分离。根据待测药物的极性或酸碱度，通过优化流动相的有机溶剂比例、pH、离子强度、离子对试剂和柱温达到分离目的。必要时可以改变反相色谱柱的类型，如碳8、碳4、交联聚苯乙烯等。
3.建立样品处理方法：
一般采用纯水作为样品基质进行预试，以了解液液萃取或固相萃取条件、试剂干扰和回收情况，然后再依次用空白样和标准品添加样品进行研究。
提取和净化方法决定于待测药物的理化性质、样品基质的性质，是否需要衍生化以及测定方法。无论最终采用何种提取或净化方法，一般均包括专门或兼有的脱蛋白质、脂肪或脱水步骤，这些常见的基质成分会干扰分析过程，污染色谱柱和检测器。
HPLC测定中，溶解样品所用溶剂要与流动相互溶，最好与流动相接近，以免干扰色谱平衡，导致色谱峰变形或保留时间改变。当反相色谱流动相中水含量高于30%时，用纯甲醇和已经制备的样品溶液进样会严重影响分离和峰型。
样品处理具体请详见：【第二届网络原创作品大赛】良好的开始，意味着成功了一半！浅谈SPE技术。
http://www.instrument.com.cn/bbs/shtml/20091004/2141153/
4.制作标准曲线
测定条件确定后，即可以配置系列浓度的的标准液制备标准曲线。至少要设置5个浓度梯度，每个梯度水平要设3次重复。制备标准曲线的浓度需要涵盖样品可能的浓度范围，不进行外推计算。可采用外标法或内标法定量。残留样品波动范围和测定误差较大，宜采用标准曲线或回归方程计算含量。
5.方法验证和评价
为评价方法的可靠性，需要进行准确度、精密度和灵敏度试验。根据这些指标可对分析方法的设计进行质量控制和评价，也便于不同分析方法间进行比较。一般开放方法要进行至少两种方法的对比并选择最好的方法。
分析方法的评价试验一般采用标准添加样品进行，是研究建立新分析方法的重要组成部分和试验依据。一般至少设立3个浓度，每个浓度水平设4次重复，经过统计处理后可同时获得各种效能指标。方法评价一般还应包括稳定性试验，包括标准溶液和样品在储存条件下的稳定性试验，如室温、冷冻和反复冷冻、解冻条件下的稳定性。
选用的分析方法还要在应用过程中采用标准样品进行定期复核，监测可能引入的任何新的系统误差。绘制质量控制图是跟踪分析质量的常用方法。如果测定结果超过警告线2次，则应该意识到分析过程可能出现问题，但不一定马上采取措施；若连续2次测定超出警告线，则必须调查原因；如果某次测定值超出警告线3次，则分析过程可能发生失控，需要停止检测分析，调查原因。若测定值持续偏于平均值某一侧，可可能引入了系统误差。
结语：我们从业人员应积极探索并建立先进的检测方法，并进行相关的验证，使之成为行业标准或国家标准将是大功一件。

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