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省部重点实验室

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发表于：2012/04/28 19:21:13 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

1.
病毒和细胞培养实验室可以设置在多种不同的房间与环境。由于细胞培养需要防止细菌和真菌的污染，因此理想的地方应该能输入经高效空气过滤层(HEPA) 过滤的正压空气。应尽量减少设备与家俱，以减少灰尘的沉积。如果没有理想的场所，那么添置一台具层流空气的生物安全柜(laminar airflow hood), 也能提供一个可供细胞培养的清洁环境。
与细胞培养相反，理想的病毒分离应该在负压环境下进行，离开房间的空气须经过HEPA过滤，以防止将任何病毒污染物释入外界环境。由于实际上大多数实验室都不能控制室内的空气流动，因此通常使用Ⅱ级或Ⅲ级的生物安全柜来从事细胞培养与病毒分离。但是应该强调，高技术的设备不能取代良好的无菌操作技术。必须严格执行正确的标本处理和病毒分离程序，既保护好工作人员自身，又要防止污染环境。
实际工作中, 通常难以建立一个具有若干个房间并使用不同排气系统的病毒分离实验室。如果必须使用单一的大房间，应将洁净区域设在房间的一端，而将清洗消毒的区域放在房间的另一端。两部分之间可以作贮存物品用，以及放置培养箱，冷藏柜，显微镜等。
一般来说，实验室应有一定的供贮存物品的空间和供仪器设备运作的场所。家俱与设备的放置在应该有利于清洁，它们的表面应该是无微孔且易于消毒的。实验室内要保持有效的空气交换，以尽可能减少有毒化学物质在室内的集聚，并保持恒定的室温与湿度。一个设计合理的实验室会大大减少细胞培养中发生污染的机会。

2. 洁净区域
因为所有的无菌操作将在洁净区域内进行，因此该区域的设置宜避开人员流动频繁的地区。洁净区域内可以每天用湿布拖地以减少灰尘。该区域内最主要的设备生物安全柜，不宜紧靠墙壁，以便于定期清洁。生物安全柜的质量要能够适合于每天的清洁工作和紫外线照射。

3. 操作区域
在设计操作区域时，须考虑到提供足够的空气流通和温度控制。桌面和地面应能耐受水、丙酮、乙醇、染色液和漂白粉消毒液。表面光滑以利于清洁。贮存玻璃仪器、吸管、注射器以及办公用品的地方应尽可能靠近操作台面。地面上不要堆置纸盒或其他贮存物品以免妨碍日常清洁工作。
不要鼓励工作人员将家里中的花盆等放入实验室。它们或许对呼吸有益，但亦可能会带入昆虫，微生物，花粉和灰尘等。
4. 清洁区域
可以安排在实验室入口，因为那儿人员流动最大。贮存标本的冰柜以及高压灭菌装置放在此处，可大大减少实验室其他区域的人员流动。同时对于这一区域的维修保养也不至于对里面的洁净区域造成大的影响。清洁区内除了有用于浸泡、清洁和干燥玻璃仪器的地方以外，还可以有一个收集病人标本的地方。除此之外，清洁区的入口处可设置供工作人员换取工作服及工作结束后洗手的场所。

5. 生物安全柜
生物安全柜有两种级别，Ⅰ级生物安全柜前面呈开放状态，空气为负压，经HEPA过滤后排出。它能保护操作者不受传染，但不适合细胞培养的操作。相反，空气水平流动的安全柜可作细胞培养用，但不能用于操作传染性病原生物。病毒的操作应使用ⅡA级生物安全柜，后者将经HEPA过滤后的垂直气流回收，再经HEPA过滤后排出，因此不仅可以保护操作者与细胞培养，还可以保护环境。安全柜可是立式，也可以是安放在桌面上的坐式。建议使用调节式坐椅，使不同身高的操作人员都能舒适而坐，并受到安全柜玻璃门罩的适当保护。
生物安全柜应为4-6尺宽，2尺深，噪声要尽可能小，否则会使操作人员易于疲劳, 甚至听不到火警或其他紧急信号。安全柜应由具资格的专业人员每年检查一次。
实验室工作人员应知道如何正确使用生物安全柜，并学会如何去除偶可发生的污染。不要在生物安全柜中存放太多的物品, 否则不但缩小了实验操作空间, 还大大减少了紫外线消毒的有效范围。当操作者的手臂或其他设备器材挡住了空气流动时，污染的气溶胶可能逃逸出安全柜。此外，生物安全柜在使用中会产生较多的热量，应注意通风。

6．显微镜
病毒室中用显微镜来观察培养管或瓶中病毒的生长情况，进行细胞计数，以及检查标本是否合适。通常需要配备倒置显微镜和荧光显微镜各一台。倒置显微镜若配以相差和干涉功能，则观察细胞时更为理想。荧光显微镜有透射光（Transmitted light）和表面射入荧光（epiflorescence incident-light）二种类型。一般而言，表面射入荧光较为理想，因为：①它不需要暗视野集光器，②可使用含最多孔隙的物镜，因此成像明亮，③标本的厚度不会干扰荧光强度。荧光显微镜的电源有3种：第一种是高压汞灯，它能产生强有力的紫外和兰色光源的激发荧光，故使用最广。100W的灯泡可提供最佳的入射光。第二种是高压氙灯，第三种是低压钨(halogen)灯，后者产生较强的可见光，可以随意地打开或关闭, 而不必等一段时间。它可作为兰色荧光的经济光源，比高压汞灯价廉而安全。但高压汞灯则产生的荧光更为明亮。
接物镜也可分三种，即acromat（消色差透镜），fluorites（萤石透镜）和apochromats（复消色差透镜）。Acromats镜片校正度最低，价格最便宜。Fluorites镜片经色原（chromatically）和球体（spherically）校正，分辩力佳，价格适中。Apocromats校正度最高，也最为昂贵。当要求视野边缘也是成像平整时，使用plan-apochromat物镜，大多数情况下不需要apochromat镜头，因为荧光是单色的。若使用上述入射光光源，物镜应具多孔隙和少镜内成分，以增加光的通过。用于观察细胞培养的倒置显微镜要配备工作范围大的目镜，以便实验人员在镜下观察培养管中的单层细胞时，细胞始终被培养液覆盖，例如6×/0.16和10×／0.22物镜。

7．水浴箱
水浴箱主要用于化冻细胞与灭活胎牛血清，因此要有足够的大小。其内壁应由防腐蚀材料构成, 以不受杀真菌和灭藻等的防腐剂之腐蚀。经常清洁水浴箱以减少细胞污染的可能。因此水浴箱的设计应便于清洁。其温度应在20—60°C范围内, 允许1°C温差。

8．离心机
病毒实验室需要离心机用于收集细胞, 分离血细胞，以及小瓶细胞培养（Shell vial）等。要配以水平转头。所有离心装置都必须有盖，以防污染。离心机须易于清洁保养。如果其电机使用碳刷，则要注意换碳刷是否方便。由于小瓶细胞培养管需要离心1小时，因此工作量大的实验室常常配备2台离心机。

9．培养箱
培养箱是病毒实验室中最主要的设备之一。CO2培养箱用于非密封的培养器皿，其培养基大多含碳酸-碳酸氢钠缓冲液。5%CO2能使含26 mM碳酸盐缓冲系统维持在pH 7.2—7.4。CO2的传输效率与湿度有关，因此CO2培养箱通常维持在35-37°C和 90—95%的饱和湿度。鉴于CO2浓度、湿度和温度对pH的控制都十分重要，培养箱应该设有安全控制，发声警报和指示警报。每周应检测一次培养箱中CO2的浓度，并保证警报系统工作正常。含Hepes缓冲液的封闭培养不一定需要CO2.
需注意培养箱经打开再重新关闭以后，其内部温度、湿度和CO2恢复正常所需要的时间。这一时间自然越短越好，但是大型培养箱比小型培养箱需要更多的时间才能恢复, 有些培养箱能快速恢复，但消耗较多的CO2。现在的培养箱内大都有一玻璃门，它能有效地减少CO2和湿度的丢失。

10. 冰箱与冷藏柜
用来保存培养基和试剂的冰箱须保持在2－8°C，而冷藏柜的温度要求在-20°C~-40°C。自动除霜的冰箱和冷藏柜的温度波动范围较大，不宜使用。病毒实验室还需要一台超低温（<70°C）的冷藏柜, 用以保存病人标本、病毒毒种与细胞株。卧式冷藏柜的容量大于立式冷藏柜，但占地面积较大。使用时应尽可能缩短冷柜开门的时间，以减少冷空气的损失，也减少门或盖上冰的积聚。冷藏柜应设有故障警报器, 并且最好能与应急电源并连。

11. 高压灭菌器
高压灭菌器用来消毒玻璃仪器和某些试剂，也用来消毒被病毒污染的器材。虽然有不少实验室选择焚烧来处理污染废物，但正确的做法应该是高压消毒后再送出实验室。高压灭菌器应该是检验合格产品, 并每年通过专业技术人员的检验。其容积应能满足消毒相关试剂,玻璃仪器以及废弃物的需要。
高压灭菌器产生的蒸气压力应该使温度达到121°C。其操作应包括自动与手动, 能用于干燥物品（快速交换，干燥）和液体（慢速交换以减少液体沸滚）。有的高压灭菌器在工作时应能保持温度记录。在有的大型机构中，人们常对锅炉产生的蒸气进行化学处理，以预防通气管道受破坏。这些化学药品可能会残留在玻璃仪器上而对细胞有毒性。因此需要向所在单位的工程技术人员咨询他们可能采用的化学物品的种类及其性质。
干烤箱可以用来消毒玻璃仪器与吸管，这通常需要维持在160°C以上至少一小时。干热不产生化学污染，但不适用于液体、大多数塑料制品和传染性废弃物。

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