主题：【分享】百度百科对二氰二氨的解释，后有检测方法

原文由 Jun Nan Li(yqfxy) 发表:
http://baike.baidu.com/view/5983693.htm?fromId=450456[/quote]

请将内容直接粘贴过来，不要引用链接。

1实验部分
1.1 仪器、试剂与材料
高效液相色谱仪，涡旋振荡器，超声波清洗机，氮吹仪。
双氰胺标准品（CAS： 461-58-5；FW=84.08），新一代Cleanert MAS-QuChERS-双氰胺净化管，Venusil HILIC液相色谱柱，微孔滤膜，乙酸铵、乙酸、乙腈为色谱纯，实验用水为超纯水。

表1 双氰胺的信息

名称	结构式	分子量	CAS
双氰胺	​	84.08	461-58-5

1.2 实验步骤
称取1g试样于50mL具塞离心管中，加2mL水，涡旋30s，加2ml乙腈涡旋30s。再往现有的提取液中加2mL乙腈，重复上述提取步骤。再将该提取步骤重复2次，得到共计约10mL的提取液。以4000r/min离心5min，将全部上清液加入新一代Cleanert® MAS-QuChERS管中（500mg/15mL），将MAS管上下晃动30s，然后涡旋30s后，8000r/min离心5min，取全部上清液（约10ml）于玻璃试管中，50℃下氮气吹干，加入1ml乙腈复溶，过0.22μm微孔滤膜，待测。
注：1.做基质加标实验时的标准溶液建议选择以水为溶剂，防止加标瞬间发生蛋白沉淀；
2.乙腈提取分4次，为防止乙腈体积过多时沉淀蛋白速度过快，影响提取效果。
1.3实验条件
1.3.1高效液相色谱法（HPLC法）：
色谱柱：Venusil® HILIC（5μm，100Å，4.6*250mm）；
流动相： 10mmol/L乙酸铵（pH=4.0）：乙腈=15: 85；
波长：220nm；进样量：10µl；柱温：30℃；流速：0.8mL/min。
1.3.2LC-MS/MS法：
（1）色谱条件：
色谱柱：Venusil® HILIC（ 5μm，100Å，2.1*150mm）；
流动相：A：0.5mmol/L乙酸铵（pH=4.0）
B：乙腈；
进样量：10µL；柱温：30℃；流速：0.3 mL/min。

表2 流动相梯度程序

时间，min	A%	B%
0	10	90
0.4	50	50
1.8	50	50
1.9	10	90
7	10	90

*备注：本文曾尝试过多种C18色谱柱，对双氰胺没有保留，需要使用离子对试剂，但是无法用于LC-MS/MS；也曾尝试过MERCK ZIC-HILIC柱，但是得到双氰胺的峰面积偏差较大，分析原因是其具有阳离子交换基团，对双氰胺有不稳定的死吸附。最后确定使用键合丙基酰胺的Venusil HILIC柱，以亲水作用色谱机理对双氰胺进行保留。
（2）质谱条件：
质谱仪：API 4000+；离子源：电喷雾离子源；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测；CAD：8.00；CUR：20.00；GS1：60.00；GS2：50.00；IS：5500.00；TEM：600.00。

表3双氰胺质谱信息

药物名称	监测离子对	DP	EP	CE	CXP
双氰胺	85.1/68.1	71	10	41	6
​	85.1/43.1	71	10	41	6

注：带“____”的监测离子对为定量离子对。

2.结果与讨论

2.1 高效液相色谱法：
2.1.1双氰胺的液相色谱图

[img=图1 双氰胺1µg/ml标准溶液的[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p]液相色谱图,220,117]http://b.hiphotos.baidu.com/baike/s%3D220/sign=1e41d75e242dd42a5b0906a9333b5b2f/b90e7bec54e736d1e6450e3f9a504fc2d56269b7.jpg[/img][/url]

图1 双氰胺1µg/ml标准溶液的液相色谱图

图1 双氰胺1µg/ml标准溶液的液相色谱图

2.1.2实际样品基质加标的线性关系和检出限
准确称取双氰胺标准品50mg于50mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，作为标准贮备液；
分别称取1g奶粉试样，添加一定量标准溶液，配制成含双氰胺为0.5µg/g，1µg/g，2µg/g，5.0µg/mL和10µg/g的添加样品，按照上述提取、净化方法操作，所得净化液按照上述色谱条件，依次进样检测。以双氰胺含量为横坐标，峰面积为纵坐标，拟合线性方程，结果见表4：

表4 双氰胺线性方程和定量限（HPLC法）

名称	保留时间	线性方程	相关系数	最低定量限（S/N=10）
双氰胺	5.57min	Y=108.16X+27.827	0.9971	0.5µg/g

2.1.3准确度和精密度
选取市售某品牌婴幼儿奶粉试样，进行添加回收实验，结果见表5

表5 0.5µg/g添加回收实验结果（HPLC法）

平行1	平行2	平行3	平均值	RSD
82.3%	85.5%	89.1%	85.63%	3.97%

[img=图2 婴幼儿奶粉空白[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p]液相色谱图,220,121]http://g.hiphotos.baidu.com/baike/s%3D220/sign=b1f16d658435e5dd942ca2dd46c6a7f5/4034970a304e251f6bf969cfa686c9177f3e53ff.jpg[/img][/url]

图2 婴幼儿奶粉空白液相色谱图

图2 婴幼儿奶粉空白液相色谱图

[img=婴幼儿奶粉0.5µg/g添加双氰胺的[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/5p]液相色谱图,220,117]http://h.hiphotos.baidu.com/baike/s%3D220/sign=e2aa65c350da81cb4ae684cf6267d0a4/f703738da9773912fcdf0856f9198618367ae208.jpg[/img][/url]

婴幼儿奶粉0.5µg/g添加双氰胺的液相色谱图

图3 婴幼儿奶粉0.5µg/g添加双氰胺的液相色谱图

2.2LC-MS/MS法
2.2.1双氰胺的LC-MS/MS图

[img=图4 双氰胺10ng/ml标准溶[url=https://insevent.instrument.com.cn/t/Yp]液质谱图,220,123]http://a.hiphotos.baidu.com/baike/s%3D220/sign=d3a6f1530823dd542573a06ae108b3df/d788d43f8794a4c265ab6a1c0ff41bd5ad6e3978.jpg[/img][/url]

图4 双氰胺10ng/ml标准溶液质谱图

图4 双氰胺10ng/ml标准溶液质谱图

2.2.2实际样品基质加标的线性关系和检出限
准确称取双氰胺标准品50mg于50mL容量瓶中，加水溶液并稀释至刻度，作为标准贮备液；
分别称取1g奶粉试样，添加一定量标准溶液，配制成含双氰胺为5ng/mL，10ng/mL，50ng/mL，100ng/mL和200ng/mL的添加样品，按照上述提取、净化方法操作，所得净化液按照上述液质条件，依次进样检测。以双氰胺含量为横坐标，峰面积为纵坐标，拟合线性方程，结果见表6：

表6 双氰胺线性方程和定量限（LC-MS/MS法）

名称	保留时间	线性方程	相关系数	最低定量限（S/N=10）
双氰胺	2.25min	Y=3859.1X+23694	0.9900	2ng/g

2.2.3准确度和精密度
选取市售某婴幼儿奶粉试样，进行添加回收实验，结果见表7。采用空白样品稀释法判断检测方法的基质效应影响。空白净化液稀释和乙腈稀释的标准溶液，双氰胺峰面积和相对丰度比无明显变化，故判断该方法无基质效应的影响。

表7 10ng/g添加回收实验结果

平行1	平行2	平行3	平均值	RSD
82.5%	83.5%	89.3%	85.2%	4.31%

图 5 婴幼儿奶粉空白质谱图

图 5 婴幼儿奶粉空白质谱图

[img=图 6 婴幼儿奶粉10ng/g添加水平的质谱图,220,130]http://e.hiphotos.baidu.com/baike/s%3D220/sign=c95a681472f082022992963d7bfbfb8a/e824b899a9014c080a17a4920b7b02087bf4f4dd.jpg[/img]

图 6 婴幼儿奶粉10ng/g添加水平的质谱图