[img=,361,274]file:///C:\Users\我是发~1\AppData\Local\Temp\ksohtml\wps_clip_image-11116.png[/img]
峰号 | 样品 | 拖尾因子 | 塔板数/米 |
1 | 丙酮 | 1.26 | 67872 |
2 | 对氯硝基苯 | 1.08 | 69884 |
3 | 甲苯 | 1.02 | 71728 |
4 | 萘 | 1.00 | 68072 |
[img=,214,250]file:///C:\Users\我是发~1\AppData\Local\Temp\ksohtml\wps_clip_image-24378.png[/img]
蛋白质提取与纯化技术
膜名称 | 分子量截留值 | 孔的大的平均直径 |
XM-300 | 300,000 | 140 |
XM-200 | 100,000 | 55 |
XM-50 | 50,000 | 30 |
PM-30 | 30,000 | 22 |
UM-20 | 20,000 | 18 |
PM-10 | 10,000 | 15 |
UM-2 | 1,000 | 12 |
UM05 | 500 | 10 |
蛋白质特性与分离纯化技术的选择 | |
|
蛋白质含量测定法及比较
本实验的目的是学会各种蛋白质含量的测定方法。了解各种测定方法的基本原理和优缺点。
蛋白质含量测定法,是生物化学研究中最常用、最基本的分析方法之一。目前常用的有四种古老的经典方法,即定氮法,双缩尿法(Biuret法)、Folin-酚试剂法(Lowry法)和紫外吸收法。另外还有一种近十年才普遍使用起来的新的测定法,即考马斯亮蓝法(Bradford法)。其中Bradford法和Lowry法灵敏度最高,比紫外吸收法灵敏10~20倍,比Biuret法灵敏100倍以上。定氮法虽然比较复杂,但较准确,往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。
值得注意的是,这后四种方法并不能在任何条件下适用于任何形式的蛋白质,因为一种蛋白质溶液用这四种方法测定,有可能得出四种不同的结果。每种测定法都不是完美无缺的,都有其优缺点。在选择方法时应考虑:①实验对测定所要求的灵敏度和精确度;②蛋白质的性质;③溶液中存在的干扰物质;④测定所要花费的时间。
考马斯亮蓝法(Bradford法),由于其突出的优点,正得到越来越广泛的应用。
一、微量凯氏(Kjeldahl)定氮法
样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨(消化),氨又与硫酸作用,变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨,借蒸汽将氨蒸至酸液中,根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例,其反应式如下:
CH2COOH
| + 3H2SO4 ® 2CO2 + 3SO2 +4H2O +NH3 (1)
NH2
2NH3 + H2SO4 ® (NH4)2SO4 (2)
(NH4)2SO4 + 2NaOH ® 2H2O +Na2SO4 + 2NH3 (3)
反应(1)、(2)在凯氏瓶内完成,反应(3)在凯氏蒸馏装置中进行。
为了加速消化,可以加入CuSO4作催化剂,K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液,滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。
计算所得结果为样品总氮量,如欲求得 样品中蛋白含量,应将总氮量减去非蛋白
氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量,即用样品中蛋白氮乘以6.25即得。
五种蛋白质测定方法比较如下:
方法 | 灵敏度 | 时间 | 原理 | 干扰物质 | 说明 |
凯氏定氮法 (Kjedahl法) | 灵敏度低,适用于0.2~ 1.0mg氮,误差为 ±2% | 费时 8~10小时 | 将蛋白氮转化为氨,用酸吸收后滴定 | 非蛋白氮(可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离) | 用于标准蛋白质含量的准确测定;干扰少;费时太长 |
双缩脲法(Biuret法) | 灵敏度低 1~20mg | 中速 20~30分钟 | 多肽键+碱性Cu2+®紫色络合物 | 硫酸铵; Tris缓冲液; 某些氨基酸 | 用于快速测定,但不太灵敏;不同蛋白质显色相似 |
紫外吸收法 | 较为灵敏 50~100mg | 快速 5~10分钟 | 蛋白质中的酪氨酸和色氨酸残基在280nm处的光吸收 | 各种嘌吟和嘧啶; 各种核苷酸 | 用于层析柱流出液的检测;核酸的吸收可以校正 |
Folin-酚试剂法(Lowry法) | 灵敏度高 ~5mg | 慢速 40~60 分钟 | 双缩脲反应;磷钼酸-磷钨酸试剂被Tyr和Phe还原 | 硫酸铵; Tris缓冲液; 甘氨酸; 各种硫醇 | 耗费时间长;操作要严格计时; 颜色深浅随不同蛋白质变化 |
考马斯亮蓝法(Bradford法) | 灵敏度最高 1~5mg | 快速 5~15分钟 | 考马斯亮蓝染料与蛋白质结合时,其lmax由465nm变为595nm | 强碱性缓冲液; TritonX-100; SDS | 最好的方法; 干扰物质少; 颜色稳定; 颜色深浅随不同蛋白质变化 |
二、双缩脲法(Biuret法)
(一)实验原理
双缩脲(NH3CONHCONH3)是两 个分子脲经180℃左右加热,放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中,双缩脲与CuSO4形成紫色络合物,称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键,或能过一个中间碳原子相连的肽键,这类化合物都有双缩脲反应。
[img=,2,12]file:///C:\Users\我是发~1\AppData\Local\Temp\ksohtml\wps_clip_image-11541.png[/img][img=,2,12]file:///C:\Users\我是发~1\AppData\Local\Temp\ksohtml\wps_clip_image-12647.png[/img] H2O
[img=,2,74]file:///C:\Users\我是发~1\AppData\Local\Temp\ksohtml\wps_clip_image-28163.png[/img][img=,2,12]file:///C:\Users\我是发~1\AppData\Local\Temp\ksohtml\wps_clip_image-4395.png[/img][img=,16,12]file:///C:\Users\我是发~1\AppData\Local\Temp\ksohtml\wps_clip_image-15282.png[/img] O=C C=O
[img=,98,43]file:///C:\Users\我是发~1\AppData\Local\Temp\ksohtml\wps_clip_image-25423.png[/img] HN NH
[img=,62,33]file:///C:\Users\我是发~1\AppData\Local\Temp\ksohtml\wps_clip_image-3406.png[/img][img=,23,12]file:///C:\Users\我是发~1\AppData\Local\Temp\ksohtml\wps_clip_image-10620.png[/img][img=,37,12]file:///C:\Users\我是发~1\AppData\Local\Temp\ksohtml\wps_clip_image-20581.png[/img] R-CH CH-R
[img=,98,22]file:///C:\Users\我是发~1\AppData\Local\Temp\ksohtml\wps_clip_image-19328.png[/img][img=,2,64]file:///C:\Users\我是发~1\AppData\Local\Temp\ksohtml\wps_clip_image-9240.png[/img][img=,62,23]file:///C:\Users\我是发~1\AppData\Local\Temp\ksohtml\wps_clip_image-12358.png[/img][img=,30,12]file:///C:\Users\我是发~1\AppData\Local\Temp\ksohtml\wps_clip_image-11983.png[/img][img=,2,12]file:///C:\Users\我是发~1\AppData\Local\Temp\ksohtml\wps_clip_image-23339.png[/img][img=,30,12]file:///C:\Users\我是发~1\AppData\Local\Temp\ksohtml\wps_clip_image-27295.png[/img][img=,2,12]file:///C:\Users\我是发~1\AppData\Local\Temp\ksohtml\wps_clip_image-6495.png[/img] O=C Cu C=O
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R-CH CH-R
[img=,2,12]file:///C:\Users\我是发~1\AppData\Local\Temp\ksohtml\wps_clip_image-8119.png[/img][img=,2,12]file:///C:\Users\我是发~1\AppData\Local\Temp\ksohtml\wps_clip_image-12759.png[/img] H2O
紫色络合物
紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关,故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1~10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有:硫酸铵、Tris缓冲液和某些氨基酸等。
此法的优点是较快速 ,不同的蛋白质产生颜色的深浅相近,以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速,但并不需要十分精确的蛋白质测定。
(二)试剂与器材
1. 试剂:
(1)标准蛋白质溶液:用标准的结晶牛血清清蛋白(BSA)或标准酪蛋白,配制成10mg/ml的标准蛋白溶液,可用BSA浓度1mg/ml的A280为0.66来校正其纯度。如有需要,标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,计算出其纯度,再根据其纯度,称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制,酪蛋白用0.05N NaOH配制。
(2)双缩脲试剂:称以1.50克硫酸铜(CuSO4·5H2O)和6.0克酒石酸钾钠(KNaC4H4O6·4H2O),用500毫升水溶解,在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液,用水稀释到1升,贮存于塑料瓶中(或内壁涂以石蜡的瓶中)。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现,则需要重新配制。
2. 器材:
可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。
(三)操作方法
1. 标准曲线的测定:取12支试管分两组,分别加入0,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0毫升的标准蛋白质溶液,用水补足到1毫升,然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后,在室温(20~25℃)下放置30分钟,于540nm处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值,以蛋白质的含量为横座标,光吸收值为纵座标绘制标准曲线。
2、样品的测定:取2~3个试管,用上述同样的方法,测定未知样品的蛋白质浓度。注意样品浓度不要超过10mg/ml。
三、Folin—酚试剂法(Lowry法)
(一)实验原理
这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法,由于其试剂乙的配制较为困难(现在已可以订购),近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。此法的显色原理与双缩脲方法是相同的,只是加入了第二种试剂,即Folin—酚试剂,以增加显色量,从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深兰色的原因是:在碱性条件下,蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。‚Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原,产生深兰色(钼兰和钨兰的混合物)。在一定的条件下,兰色深度与蛋白的量成正比。
Folin—酚试剂法最早由Lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。以后在生物化学领域得到广泛的应用。这个测定法的优点是灵敏度高,比双缩脲法灵敏得多,缺点是费时间较长,要精确控制操作时间,标准曲线也不是严格的直线形式,且专一性较差,干扰物质较多。对双缩脲反应发生干扰的离子,同样容易干扰Lowry反应。而且对后者的影响还要大得多。酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。浓度较低的尿素(0.5%),硫酸纳(1%),硝酸纳(1%),三氯乙酸(0.5%),乙醇(5%),乙醚(5%),丙酮(0.5%)等溶液对显色无影响,但这些物质浓度高时,必须作校正曲线。含硫酸铵的溶液,只须加浓碳酸钠—氢氧化钠溶液,即可显色测定。若样品酸度较高,显色后会色浅,则必须提高碳酸钠—氢氧化钠溶液的浓度1~2倍。
进行测定时,加F olin—酚试剂时要特别小心,因为该试剂仅在酸性pH条件下稳定,但上述还原反应只在pH=10的情况下发生,故当Folin一酚试剂加到碱性的铜—蛋白质溶液中时,必须立即混匀,以便在磷钼酸—磷钨酸试剂 被破坏之前,还原反应即能发生。
此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。
此法可检测的最低蛋白质量达5mg。通常测定范围是20~250mg。
(二)试剂与器材
1.试剂
(1)试剂甲:
(A) (A) 10克 Na2CO3,2克 NaOH和0.25克酒石酸钾钠 (KNaC4H4O6·4H2O)。溶解于500毫升蒸馏水中。
(B) (B) 0.5克硫酸铜(CuSO4·5H2O)溶解于100毫升蒸馏水中,每次使用前,将50份(A)与1份(B)混合,即为试剂甲。
(2)试剂乙:
在2升磨口回流瓶中,加入100克钨酸钠(Na2WO4·2H2O),25克钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)及700毫升蒸馏水,再加50毫升85%磷酸,100毫升浓盐酸,充分混合,接上回流管,以小火回流10小时,回流结束时,加入150克 硫 酸 锂(Li2SO4),50毫升蒸馏水及数滴液体溴,开口继续沸腾15分钟,以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄色(如仍呈绿色,须再重复滴加液体溴的步骤)。稀释至1升,过滤,滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准NaOH滴定,酚酞作指示剂,然后适当稀释,约加水1倍,使最终的酸浓度为1N左右。
(3)标准蛋白质溶液:
精确称取结晶牛血清清蛋白或 g—球蛋白,溶于蒸馏水,浓度为250 mg/ml左右。牛血清清蛋白溶于水若混浊,可改用0.9 % NaCl溶液。
2. 器材
(1)可见光分光光度计
(2)旋涡混合器
(3)秒表
(4)试管16支
(三)操作方法
1. 标准曲线的测定:取16支大试管,1支作空白,3支留作未知样品,其余试管分成两组,分别加入0,0.1,0.2,0.4,0.6,0.8,1.0毫升标准蛋白质溶液(浓度为250mg/ml)。用水补足到1.0毫升,然后每支试管加入5毫升试剂甲,在旋涡混合器上迅速混合,于室温(20~25℃)放置10分钟。再逐管加入0.5毫升试剂乙(Folin—酚试剂),同样立即混匀。这一步混合速度要快,否则会使显色程度减弱。然后在室温下放置30分钟,以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照,于700nm处测定各管中溶液的吸光度值。以蛋白质的量为横座标,吸光度值为纵座标,绘制出标准曲线。
注意:因Lowry反应的显色随时间不断加深,因此各项操作必须精确控制时间,即第1支试管加入5毫升试剂甲后,开始计时,1分钟后,第2支试管加入5毫升试剂甲,2分钟后加第3支试管,余此类推。全部试管加完试剂甲后若已超过10分钟,则第1支试管可立即加入0.5毫升试剂乙,1分钟后第2支试管加入0.5毫升试剂乙,2分钟后加第3支试管,余此类推。待最后一支试管加完试剂后,再放置30分钟,然后开始测定光吸收。每分钟测一个样品。
进行多试管操作时,为了防止出错,每位学生都必须在实验记录本上预先画好下面的表格。表中是每个试管要加入的量(毫升),并按由左至右,由上至下的顺序,逐管加入。最下面两排是计算出的每管中蛋白质的量(微克)和测得的吸光度值。