主题：关于军团菌检测

可以采用免疫层析技术
试剂盒检测
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军团菌监控是目前的热点，方法还是传统培养法，国内主要采用ISO11731-1998标准，具体检测方法和产品可登陆 www.beijinglandbridge.com查询，有翻译好的中文！

军团菌简介

《伯杰氏细菌分类手册》1994年第9版中，对军团菌（Legionella）作了如下说明：杆形菌，宽度0.3~0.9μm，长度为2~20μm以上，不形成内孢子或小囊，无荚膜，不产酸，革兰氏染色阴性，借一两根或以上直的或弯曲的极鞭毛和侧鞭毛可以运动，偶尔可见无动力菌株。需氧，生长时需L-半胱氨酸和铁盐。氧化酶阴性或弱阳性，硝酸盐还原试验阴性，尿素酶阴性，液化明胶。细胞壁中有支链脂肪酸。可从有机化合物中摄取营养，可利用氨基酸作为能量来源。不发酵碳水化合物，亦不能使之氧化。可从地表水、泥土和热水及污染的湖水和河水中分离到本菌，但从土壤和动物中分离尚不了解，对人有致病性，DNA的G+Cmol%含量为39~43%（TmBd）。

军团菌属有41个种，61个血清型。侵肺军团菌（Legionella pneumophila, LP）有15个血清型，是引起军团菌病的主要菌型（占80%以上）。军团菌病是一种急性呼吸道传染病，临床类型目前至少有肺炎型与庞蒂阿克热型。本病主要为呼吸道飞沫(气溶胶)传播。目前尚无证据表明感染者、病人或感染动物作为本病的传染源，通常把传染本菌的水源(天然水、人工管道水源、冷却塔、冷热管道系统水等)作为传染源。

军团菌的检测方法——ISO11731:1998

1．  范围

本标准描述了一种用于军团菌分离和估计环境样品中军团菌数量的培养方法。

该方法适用于所有环境样本，包括饮用水、工业用水和天然水以及沉淀物、沉积物和粘土/软泥等相关样本。

2．  培养基和试剂

2.1 Buffered Charcoal Yeast Extract agar medium （BCYE）

2.2 Buffered Charcoal Yeast Extract medium without L-cysteine （BCYE-Cys）

2.3 Buffered Charcoal Yeast Extract medium with selective supplements （GVPC）

2.4酸处理缓冲液

陆桥公司产品一览表

产品

货号
产品名称
规格( g )
价格

（元）
产品说明及用途

CM166
BCYE琼脂基础
100
1600.00
用于军团菌培养，添加P-63、P-64可制备BCYE琼脂；只添加P-64可制备BCYE-Cys琼脂

P-63
L-半胱氨酸盐酸盐
0.04g/支×5
25.00
每支添加于100mlCM166中

P-64
可溶性焦磷酸铁
0.025 g/支×5
25.00
每支添加于100mlCM166中

CM167
GVPC琼脂基础
100
1750.00
用于军团菌选择性分离培养

CM167A
GVPC添加物
5支/盒×1盒
25.00
将5支试剂无菌添加于100mlCM167中


3．  取样

3.1取样容器

水样可采用玻璃、聚乙烯或类似容器。以前用过的容器应该清洗干净、扣干水分，121℃高压灭菌15min。如果容器不能经受高压灭菌，应在〉70℃的流动热水或流动蒸汽中处理至少5min。

3.2含生物防腐剂的样品

如果水样中含有或被认为含有氧化型生物防腐剂，应在取样时或取样前加入非活性试剂加以中和。

原则上讲，实验室接到水样后应尽快进行微生物学分析，最好是取样当天，尤其对于已知含生物防腐剂的样品。因此，建议从样品采集到制备好浓缩样的间隔最好为2d，不应超过5d，最长不超过14d。

3.3样品运输

样品应在6-18℃条件下被运输，应避免热和光照，最好在1d内，不超过2d将样品送到指定实验室。

4．  制样

4.1 总则

如果液体样品军团菌的数量估计超过105/l，可以采用直接平板法。为了确保低于这个数量样品中军团菌的检测，需采用浓缩技术。为了浓缩水样，可采用膜过滤法（4.2）或离心法（4.3）。

4.2膜过滤法

如果样品是浑浊的、乳浊的或有颜色的，应采用离心法。

采用膜过滤装置进行膜过滤，采用直径47-147mm，孔径0.22μm和0.45μm的膜。过滤后的膜应放置在带盖的无菌容器中，可用无菌剪刀剪碎，加5ml-25ml的无菌稀释液或无菌去离子水，不断摇动至少2min。也可将容器放入超声波中2-10min。

4.3离心法

取200ml样品于300-500ml容积的离心瓶中，6000g离心10min或3000g离心30min，保持温度在15-25℃，弃去上清液，将沉淀物悬浮在2-20ml无菌稀释液或无菌去离子水中。

5．  培养

5.1将制备好的样品（浓缩的或未浓缩的）分成3份，1份不做任何处理；1份进行热处理；1份进行酸处理。

5.2热处理

加1±0.5ml样品于一无菌容器中，50±1℃水浴处理30±2min。

5.3酸处理

加1-10ml样品于一拧盖的容器中，6000g离心10min或3000g离心30min，用无菌枪头吸去一半体积的上清液，通过涡旋重新悬浮剩余物，用酸处理缓冲液补足原始体积。混合静置5±0.5min。

5.4选择性培养基的接种

分别接种未处理、热处理和酸处理的样品0.1-0.5ml于GVPC培养基上，热处理和酸处理的样品应在处理完立即接种，记录接种体积。

5.5培养

翻转平板，36±1℃培养10d。

5.6检查平板

在10d的培养期间，用显微镜在2-4d内至少观察3次，军团菌生长较慢，很可能被其他菌掩盖，记录每一种菌落形态的数量。

注：军团菌的菌落通常是白-灰-蓝-紫，但也可能出现棕色、粉色、灰绿色或深红色。军团菌表面光滑，边缘整齐，出现典型的毛玻璃现象。在紫外光下， L.bozemanii, L.gormanii, L.dumoffii, L.anisa, L.cherrii, L.steigerwaltii, L.gratiana, L.tucsonensis和L.parisiensis有亮白色荧光；L.rubrilucens 和L.erythra呈现红色；L.pneumophila菌落呈现暗绿色通常伴随有黄色。荧光的颜色有助于区分样品中军团菌的不同种。为了避免军团菌的死亡，不能将平板长时间暴露在紫外灯下。

6．可疑军团菌的确证

6.1BCYE和其他培养基的二次培养

从每个GVPC平板上至少选择3个可疑军团菌菌落接种到BCYE和BCYE-Cys两块平板上进行二次培养，36±1℃培养至少2d。在BCYE上生长而在BCYE-Cys上不生长的被认为是军团菌。通过血清学实验（6.2）确证在BCYE上生长而在BCYE-Cys上不生长的菌落。

注：血琼脂和营养琼脂可以代替BCYE-Cys培养基。

6.2免疫荧光法鉴定军团菌

《公共场所集中空调通风系统卫生规范》(卫生部，2006年) 
时间：2006年02月24日　　文章录入：网络资源管理员2





4.1 集中空调通风系统冷却水和冷凝水中不得检出嗜肺军团菌。

4.2 集中空调通风系统新风量应符合表1的要求。

5.7 集中空调通风系统使用的空气净化消毒装置性能检验

5.7.1性能检验应在实验室和现场分别进行。

5.7.2 装置阻力的实验室检验方法见附录E。

5.7.3 颗粒物净化效率实验室检验方法见附录F。

5.7.4 微生物净化效率、消毒效果检验方法见附录G。

5.8 集中空调通风系统使用消毒剂的评价采用卫生部消毒技术规范中规定的方法。

5.9 集中空调通风系统风管内表面积尘量的检验方法见附录H。

5.10 集中空调通风系统风管内表面微生物的检验方法见附录I。


6 本规范自2006年3月1日起实施。




附录A

冷却水、冷凝水中嗜肺军团菌检验方法


本附录规定了集中空调通风系统冷却水、冷凝水及其形成的沉积物、软泥等样品中嗜肺军团菌的检验方法。


A1原理

待测水样经过滤膜或离心浓缩后，一部分样品经酸处理与热处理，以减少杂菌生长，一部分样品不作处理。将上述处理与未处理样品分别接种BCYE琼脂平板并进行培养，生成典型菌落并经生化培养和血清学实验鉴定确认则判定为嗜肺军团菌。

A2 主要仪器设备

A2.1 平皿：90mm

A2.2 培养箱：35~37℃

A2.3 紫外灯：波长360±2nm

A2.4 滤膜滤器

A2.5 滤膜：孔径0.22～0.45µm

A2.6 蠕动泵

A2.7 离心机

A2.8 涡旋振荡器

A2.9 普通光学显微镜、荧光显微镜、体式镜

A2.10 水浴箱

A3 采样

A3.1 采样容器：可选择玻璃瓶或聚乙烯瓶，沉积物与软泥需用广口瓶，容器均需螺口或磨口，用前灭菌。

A3.2 采样量：每个采样点依无菌操作取水样（或沉积物、软泥等样品）约200ml。

A3.3 中和：经氯或臭氧等消毒的样品，采样容器灭菌前加入硫代硫酸钠溶液以中和样品中的氧化物。

A3.4 样品运输与贮存：样品最好2天内送达实验室，不必冷冻，但要避光和防止受热，室温下贮存不得超过15天。

A4  方法与步骤

A4.1 样品处理

A4.1.1 沉淀或离心：如有杂质可静置沉淀或1000r/min离心1min去除。

A4.1.2 过滤：将经沉淀或离心的样品通过孔径0.22～0.45µm滤膜过滤，取下滤膜置于15ml灭菌水中，充分洗脱，备用。

A4.1.3 热处理：取1ml洗脱样品置50℃水浴加热30min。

A4.1.4 酸处理：取5ml洗脱样品，调pH至2.2，轻轻摇匀，放置5min。

A4.2 接种与培养：取A4.1.2洗脱样品、A4.1.3 热处理样品及A4.1.4 酸处理样品各0.1ml，分别接种GVPC平板。将接种平板静置于CO2培养箱中，温度为35~37℃，CO2浓度为2.5%。无CO2培养箱可采用烛缸培养法。观察到有培养物生成时，反转平板，孵育10天，注意保湿。

A4.3 观察结果：军团菌生长缓慢，易被其它菌掩盖，需每天在体式镜上观察。军团菌的菌落颜色多样，通常呈白色、灰色、蓝色或紫色，也能显深褐色、灰绿色、深红色；菌落整齐，表面光滑，呈典型毛玻璃状，在紫外灯下，有荧光。

A4.4 菌落验证：从每一个平皿上挑取2个可疑菌落，接种BCYE和L－半光氨酸缺失的BCYE琼脂平板，35~37℃培养2天，凡在BCYE琼脂平板上生长而在L－半光氨酸缺失的BCYE琼脂平板不生长的则为军团菌菌落。

A4.5嗜肺军团菌型别的确定：应进行生化培养与血清学实验确定嗜肺军团菌。生化培养：氧化酶（－/弱+），硝酸盐还原－，尿素酶－，明胶液化＋，水解马尿酸。血清学实验：用嗜肺军团菌诊断血清进行分型。

天气开始热了，渐渐的有人开始用空调了。公共场所的集中空调需要定期检测军团菌。
军团菌的相关标准包括：
GB/T 18204.5-2013公共场所卫生检验方法 第5部分：集中空调通风系统
化工行业标准HG_T 4323-2012 循环冷却水中军团菌的检测与计数
SN/T 2528-2010 饮用水中军团菌检测
水质 军团藻属的检测和计数 ISO 11731-1998
WS 394-2012 公共场所集中空调通风系统卫生规范 附录B 冷却水、冷凝水中嗜肺军团菌检验方法 等
军团菌检测需要用到：
GVPC平板,BCYE平板，BCYE-CYS平板
军团菌分型诊断血清
军团菌生化鉴定套装（包括硝酸盐还原，马尿酸盐等生化管）
军团菌阳性对照菌株
360nm紫外灯（荧光实验）、紫外防护眼镜
军团菌PCR试剂盒等
厦门敏测实验器材公司有供应军团菌检测系列产品，如有需要请与我们联系。