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主题：【分享】《CNW液相色谱柱使用征文大赛之六》：CNW Athena C18-WP色谱柱测定镇江香醋中有机酸含量及色谱柱性能测试

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发表于：2014/05/09 14:38:21 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

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CNW Athena C₁₈-WP色谱柱测定镇江香醋中有机酸含量及色谱柱性能测试

1. 实验背景及目的

镇江香醋是我国传统名醋，拥有悠久的历史，在国内外都享有盛益。镇江香醋采用传统的固态分层发酵工艺，其酿造的成品醋，具有酸而不涩、香而微甜、色浓味鲜、愈存愈香等特点。镇江香醋的味感，主要受有机酸、氨基酸、糖分等成分影响，其中有机酸是镇江香醋最主要的风味物质，其组成和含量对食醋的酸味质量和产品特色有重大影响。

不同地域的食醋由于酿造工艺、原料、地理环境等因素的不同，其有机酸的组成及含量存在着较大的差异性，因此建立镇江香醋中有机酸的测定与分析方法，不仅有利于镇江香醋质量鉴定与评价，而且有利于提高镇江香醋生产过程的技术管理，增加优质镇江香醋的出品率。GB/T 18623-2011 《地理标志产品镇江香醋》中要求镇江香醋中含有乳酸、乙酸、焦谷氨酸和琥珀酸4种特征有机酸，对这4种有机酸，尤其乳酸和乙酸的百分含量有了明确的规定，并将其作为镇江香醋考核和评判的依据。作为食品监管部门和镇江香醋检验的重要检测机构，亟需对食醋中有机酸含量测定建立快速、高效、准确且符合国家标准的检测方法。

2 实验方法

2.1 仪器与试剂

Waterse2695液相色谱仪（主要包括2998光电二极管矩阵检测器，柱温箱，自动进样器，自动脱气四元梯度泵等）； pHS-3C型酸度计，上海雷磁仪器厂；Mettler Toledo电子天平，梅特勒托利上海仪器有限公司；镇江香醋，江苏恒顺醋业股份有限公司。

亚铁氰化钾（分析纯）、硫酸锌（分析纯）、磷酸（分析纯）、磷酸二氢钠（分析纯），江苏强盛化工有限公司；甲醇（色谱纯），美国Tedia公司；乳酸、乙酸、焦谷氨酸、琥珀酸均为色谱纯，Sigma-Aldrich 公司；超纯水（由Mill-Q纯水器系统制得）。

2.2 色谱条件

色谱柱：CNW Athena C₁₈-WP(250mm×4.6mm,5μm)；流动相：10mmol/L磷酸二氢钠溶液（用1mol/L磷酸调节pH值为3.0），使用前经0.45μm滤膜过滤；流速：1.0mL/min；柱温：30℃；检测波长：210nm。

2.3 样品预处理

取样品5mL镇江香醋于100mL容量瓶中，分别加入2mL亚铁氰化钾（10.6%）和2mL硫酸锌（30%）溶液，摇匀后用超纯水定容，静置沉淀30min；取上清液，经0.45μm滤膜过滤后进样分析。

3 结果和讨论

3.1流动相的选择

有机酸为弱酸，易在水系流动相中发生解离而不能在反相固定相上保留。但有机酸的解离常数较小（pKa＞2），因此采用离子抑制的方法可以抑制有机酸在流动相中的解离，增加有机酸在反相固定相上的保留，改善分离效果。磷酸盐缓冲溶液能够有效抑制有机酸的解离，使有机酸在非极性固定相C₁₈柱上保留和分离，同时磷酸盐缓冲溶液在210nm左右几乎没有吸收，作为测定有机酸的流动相可改善有机酸的分离而不影响检测。

3.2 流动相浓度的选择

磷酸盐缓冲溶液浓度的高低直接影响其缓冲容量的大小，影响有机酸在流动相中的存在形式及溶液的离子程度。缓冲盐浓度越高，有机酸的存在形式越稳定，但随着其浓度的增加，离子强度也增大，流动相的本底吸收增加，降低了测定的灵敏度。本实验配制浓度分别为0mol/L, 5mmol/L, 10mmol/L,20mmol/L，40mmol/L的NaH₂PO₄缓冲溶液，对标准混合溶液中的有机酸进行分离。结果表明：当流动相中不含有磷酸盐时，各种有机酸并不能很好的分离；磷酸盐的加入，抑制了有机酸在流动相中的解离，各种有机酸得到有效的分离，但随着磷酸盐浓度的增加，乳酸和乙酸的分离度降低，同时，高浓度的缓冲盐会对泵和色谱柱的使用寿命产生影响，故本实验采用10mmol/LNaH₂PO₄缓冲溶液作为流动相。

3.3流动相pH值的选择

有机酸均为弱酸，在水溶液中存在着一定的解离平衡，其解离程度受溶液pH值影响，提高H⁺浓度可抑制有机酸在流动相中的解离，使有机酸尽可能以分子形式存在。用磷酸调节流动相的pH值，测定不同pH值下各种有机酸的分离情况和保留时间变化，结果表明：在pH大于4.0时，4种有机酸在流动相中发生解离而未能在反相固定相上保留；随着H⁺浓度的提高，有机酸的解离被抑制，在固定相上保留，当pH=3.5时，4种有机酸在色谱柱上发生分离，但是色谱峰的对称性较差，且焦谷氨酸与乙酸的色谱峰不能完全分离；当pH=3.0时，4种有机酸已经能够完全分开，分离度和对称性都达到检验要求；随着H⁺浓度的进一步增加，乳酸和乙酸的分离度减小，焦谷氨酸和琥珀酸的保留时间延长；当pH值为2.0时，乳酸和乙酸不能完全分离。由于色谱柱的填料通常要求流动相的pH值在2-8之间，流动相酸性越强化学键合基团的水解作用也就越容易发生，过低的流动相pH值会影响色谱柱的使用寿命，故选择pH值为3.0时的磷酸盐缓冲液为流动相。不同pH值下CNW Athena C₁₈-WP对4种有机酸分离色谱图见图1。

图1 不同pH值下CNW Athena C₁₈-WP对4种有机酸分离色谱图（a）pH=4.0；（b）pH=3.5 ;(c)pH=3.0;(d) pH=2.5;(e) pH=2.0;(f)重叠色谱图

3.4 流动相流速的选择

分别考察温度为30℃，流动相为10mmol/L NaH₂PO₄（pH=3.0）时，0.5、0.8、1.0和1.2mL/min的4种流动相流速对有机酸分离效果的影响，结果表明：随着流速的增加，有机酸的出峰时间明显缩短，但乳酸和乙酸的分离度减小，同时柱压升高，不利于色谱柱的保护和长期使用。减小流动相流速，乳酸和乙酸的分离度略有增大，而有机酸的出峰时间均延长。因此，选择本实验选择在室温30℃，流动相流速为1.0mL/min及流动相浓度为10mmol/L NaH₂PO₄（pH=3.0）的色谱条件下对样品进行分离。

3.5 色谱柱的选择

分别选择CNW Athena C₁₈-WP、Welch Materials AQ-C₁₈、Kromasil C₁₈、Waters SymmetryShield RP₁₈和AT Lichrom C₁₈5根不同生产厂家、性能接近的C₁₈色谱柱，在相同色谱条件下对标准储备液进行测定，考察5根色谱柱的分离性能及各项参数。5根色谱柱的规格型号见表1，色谱条件同2.2。图2为各色谱柱对4种有机酸的分离色谱图。根据Waters公司的Empower软件进行系统适应性分析，分析结果见表2。结合表1、表2和图2可以看出，在该色谱条件下，5根不同生产厂家的C₁₈色谱柱对这4种有机酸具有很好的分离性能，4种有机酸的分离度均大于1.5。由于乙酸和乳酸出峰时间较为接近，两者的分离度相对较小，是测定食醋中4种特征有机酸时较难分离的两种组份，5根色谱柱中CNW Athena C₁₈-WP对乳酸和乙酸的分离度最大，达到2.48，但是该色谱柱对琥珀酸的拖尾因子较大。由于CNW Athena C₁₈-WP色谱柱对乳酸和乙酸有较好的分离度，且有较好的柱效和系统压力，以及其具有优势的性价比，因此用该色谱柱进行食醋中4种有机酸的测定分析。

表1 色谱柱规格型号及柱压

图2 不同色谱柱在相同色谱条件下对4种有机酸分离的色谱图。（a）CNW Athena C₁₈-WP；（b）Welch Materials AQ-C₁₈ ;(c) Kromasil C₁₈；(d) Waters SymmetryShield RP₁₈;(e) AT Lichrom C₁₈

表2 不同色谱柱系统适应性测试结果

（a）CNW Athena C₁₈-WP；（b）Welch Materials AQ-C₁₈; (c) Kromasil C₁₈；(d) Waters SymmetryShield RP₁₈; (e) AT Lichrom C₁₈

3.6 样品预处理

食醋中富含蛋白质、色素、有机酸等物质，成份十分复杂，因此在前处理阶段，应该选择有效的方法将这些杂质分离。乙腈、甲醇、三氯乙酸、亚铁氰化钾和乙酸锌等是常用的蛋白质沉淀剂，本实验分别采用甲醇、亚铁氰化钾和乙酸锌沉降食醋中的蛋白质，并另将食醋样品直接稀释，按上述液相条件进行测定，考察预处理方法对实验结果的影响，见表3和图3。从表3中可以看出，不同样品预处理方法对4种有机酸含量测定的实验结果影响较小，但从图3中可以看出，经甲醇及亚铁氰化钾和乙酸锌预处理过的样品瓶底有大量的沉淀物，上层清液透明、澄清且接近无色，极大的降低了样品对色谱柱的危害，而直接稀释定容的食醋样品颜色较深，且瓶底无沉淀物。采用直接稀释进样的方法测定食醋中的有机酸，极易引起色谱柱柱压升高，柱效下降，污染色谱系统。由于甲醇为有机溶剂，与亚铁氰化钾和乙酸锌相比，对人体及环境具有一定的危害性，因此推荐采用亚铁氰化钾和乙酸锌对样品进行预处理。依据方法3对镇江香醋预处理，采用CNW Athena C₁₈-WP色谱柱及2.2方法进行实际样品测试的色谱图见图4。由于食醋中有机酸含量种类丰富，在实际样品检测时需延长样品检测时间，否则会干扰下一样品的检测。在上述试验条件下，样品检测时间延长至30min较为合适。

表3 不同样品预处理方法对实验结果的影响

注：实验结果以峰面积表示；方法1为亚铁氰化钾和硫酸锌处理样品;方法2为甲醇处理样品;方法3为食醋样品直接稀释定容

图3 预处理方法对食醋样品的影响。1为亚铁氰化钾和硫酸锌处理样品;2为甲醇处理样品;3为食醋样品直接稀释定容

图 4 CNW Athena C₁₈-WP色谱柱对镇江香醋样品中有机酸分离色谱图

3.7 标准品配制、标准曲线和检出限

准确称取乳酸、乙酸及琥珀酸各200mg，焦谷氨酸50mg，用超纯水溶解并定容至50mL容量瓶中，配成4种有机酸的混合标准储备液。并将上述溶液用超纯水稀释，配制成一系列浓度的有机酸混合标准溶液，用0.45μm滤膜过滤后，上机测试并绘制4种有机酸的标准曲线。

图5 乳酸、乙酸、焦谷氨酸和琥珀酸的标准曲线

以样品峰面积Y(mV)对有机酸质量浓度X（μg/mL）经过线性回归得到4种有机酸的线性回归方程，见图5。乳酸、乙酸、琥珀酸在40.00~400.00μg/mL范围内，焦谷氨酸在10.00~100.00μg/mL范围内呈良好的线性关系，4种有机酸的相关系数都大于0.999。对标准溶液不断稀释，测定4种有机酸的检出限，结果见表4。

表4 4种有机酸的线性回归方程和检出限

3.8 方法的回收率

同时取镇江香醋样品2份，其中1份作本底，往另外一份中加入一定浓度的有机酸混合标准溶液，按上述实验方法进行测定，考察实验方法的回收率。测定结果见表5。

表5 四种有机酸加标回收率

3.9 CNW AthenaC₁₈-WP性能测定

由于本实验方法采用的是纯缓冲盐体系，同时缓冲盐具有酸性，因此要求色谱柱需要具有一定的耐酸和耐纯水的性能。CNW Athena C₁₈-WP色谱柱可用于100%水流动相，且pH适用范围在1.5-10之间，满足实验条件的要求。为了进一步考察CNW Athena C₁₈-WP色谱柱在本实验条件下的耐受性，对该色谱柱的耐酸性、耐水性及停流实验进行测试。

普通反相填料在使用高比例水为流动相时，键和的官能团由于疏水作用，流动相不浸润固定相表面，色谱柱失去对化合物的保留能力，即发生“疏水塌陷”，同时，酸性条件容易造成化学键合基团水解，从基体硅胶上脱离，水解作用导致分析物保留时间明显改变，从而使色谱柱寿命缩短，重现性差。

耐酸性和耐水性能测试方法：将CNW Athena C₁₈-WP色谱柱在2.2方法条件下连续运行，并每隔2小时对有机酸标准储备液测试一次，测试9次。以保留时间、峰面积、峰高、USP分离度、USP理论塔板数、USP拖尾对色谱柱性能进行考察。实验结果见表6和表7。表6为9次测试的精密度，表7为第1次测试和第9次测试，系统适应性结果的比较。从这2张表中可以看出，CNW Athena C₁₈-WP色谱柱具有很好的耐酸性能和耐水性能，9次测试结果的偏差均较小，且对峰形影响也不大。

表6 CNW Athena C₁₈-WP色谱柱耐酸性能和耐水性能测试精密度结果（n=9）

表7 CNW Athena C₁₈-WP色谱柱耐酸性能和耐水性能测试结果

（a）第1次进样系统适应性结果；（b）第9次进样系统适应性结果；

据研究，疏水塌陷一般发生在流动相停止后再流动的阶段。所以停流实验也可以验证填料的耐水性。实验方法：用100%磷酸盐缓冲盐流动相1.0mL/min流速冲2小时，流速逐渐降为0.0mL/min后停泵1小时之后再恢复100%磷酸盐缓冲盐流动相，平衡一段时间测试柱效，比较停流前后保留的差异。停流前后4种有机酸分离的色谱图及系统适应性结果分别见图6和表8。从图6和表8中可以看出，CNW Athena C₁₈-WP色谱柱具有很好的耐水性能，停流实验对色谱柱的影响较小。


（a）	（b）

图6 停流实验结果（a）停流前4种有机酸分离色谱图；（b）停流后4种有机酸分离色谱图

表8 停流实验结果（a）停流前色谱柱系统适应性结果；（b）停流后色谱柱系统适应性结果

4 小结

利用CNW Athena C₁₈-WP色谱分析柱，建立了高效液相色谱法测定食醋中乳酸、乙酸、焦谷氨酸和琥珀酸4种特征有机酸的分析方法，并对样品预处理方法及色谱条件进行了优化。

对CNW Athena C₁₈-WP的色谱柱在该实验条件下的性能进行了简单的分析和测试。CNW Athena C₁₈-WP对4种特征有机酸有很好的分离性能，分离度均大于1.5，尤其是对乳酸和乙酸的分离能力，大于本次实验中测试的其他色谱柱，并表现出较高的理论塔板数。CNW Athena C₁₈-WP具有较好的耐酸性能和耐水性能，在停流实验中也表现出较好的色谱性能。

虽然CNW Athena C₁₈-WP在本次实验中表现出较好的色谱性能，但是仍存在一些问题，具体如下：

（1）对琥珀酸的拖尾较为严重，且当乙酸浓度较高时，拖尾较为严重（可能是柱饱和的原因）；

（2）在实验中出现色谱峰时间的漂移。单标与混标溶液中相同组分出峰时间有漂移，如单标时，乳酸和乙酸的出峰时间分别为5.891和6.190，而在混标中，这两种物质的出峰时间分别为5.845和6.398。单标的出峰时间和峰形见下图。但是单标的精密度和混标的精密度都很好，混标的精密度见上文。