41、UPLC色谱柱可以反冲吗?HPLC的色谱柱可以简单反冲,但是,UPLC的色谱柱.也是一样的吗?如果压力偏高,该怎么办?
答:如果两端筛板孔径对称,UPLC柱应该也是可以反冲的。发现压力偏高,当然也可以用反冲清洗的方法维护,UPLC柱和普通色谱柱比,只是压力高一点,不应该有什么特殊吧。
42、常规LC的柱子粒度小,柱效高,现在有3.5um的常规柱,不知道用3.5um*250的压力与4.6um的压力相差多少?
答:一般柱子4.6mmx250mm指的是其内径和长度。粒径才用um的单位,但一般标的是5um,也有3.5um的。其它条件一样,光粒径是3.5um和5um的柱压差别,理论上3.5um柱子的柱压是5um柱子的(5/3.5)平方倍数,即2.04倍,简单说就是2倍。
43、因为不知道流动相已走完,液相色谱柱空走了大概一晚上,请问这种情况下柱子还能用吗?如果可以应该如何再生?
答:能用的!可能柱子里会有气泡进去,但之后多用流动相冲冲,看到基线稳定,就没问题了。用色谱柱的保存液低流速长时间冲洗,然后再检测一下柱效,看柱子是否恢复,
液相最好设置一下最低压限,这样就不怕流动相走光而会损伤色谱柱。
44、在梯度洗脱的时候,如果整个时间程序越长,保留时间的重现性越差,尤其是后出的峰重现性差更明显,我猜估计是流量本身的误差引起的,但是怎么尽量避免这种情况的出现,使保留时间重现性更好?
答:这个要控制好环境温度和柱温,易挥发的流动相要适当密封,同时保留时间的漂移与仪器的精度也有关系。
45、我对聚苯乙烯-二乙烯苯柱很有兴趣,主要是它耐高温、耐酸碱、但有关这方面的文献很少,但对于他的分离效能我一直心里没底,我的问题有三:1、分离效果与ODS比较,是相当呢,还是更胜一筹,或是更差?2、我原以为它是整体住,但看过资料后发现也是颗粒的比如5u,请问该类型的柱是否符合速率理论、是不是粒径越小分离效果会几何级的增加?3、问什么没有1.7u的这种柱出现呢?
答:聚合物基质色谱柱的优点你已经提到了,它的缺点有:对小分子分离的柱效相对硅胶基质色谱柱要低,表面衍生化修饰也没有在硅胶表面丰富,机械强度低耐压性不好,还有碰到某些有机溶剂会溶胀等。聚合物基质柱当然也符合速率理论!它柱效低主要是因为分析物在聚合物固定相中的传质速度比在硅胶表面固定相中慢很多。不过粒径越小柱效几何级增加的规律还是有的。1.7um的硅胶基质填料也是最近几年才商品化,1.7um的聚合物基质没出来也正常,或许永远都不出来了,因为聚合物耐压差,粒径做这么小,它根本承受不了这个高压吧,但愿以后会有能抗高压的聚合物填料研究出来。
46、如何改善峰形?(前伸峰、拖尾峰)
答:前伸峰是由于色谱柱过载。当一种或多种化合物的进样量超过色谱柱固定相容量时,可能发生这种情况。
液相膜越薄,色谱柱中保留的每种化合物就越少。这涉及到进样体积和进样中每个峰的化合物浓度。通过减少进样量、分流样品或进样浓度较低的样品,可减小进样体积。
47、“样品与离子对生成紧密的结合物,离子对试剂掩藏化合物中的极性基团”这句话是什么意思?离子对怎么样掩蔽化合物中极性基团?不就是通过静电引力的作用形成离子缔合物,来降低其极性的吗?
答:离子对色谱是解决强极性物质在反相色谱中保留能力不足的一个有效的途径。有些碱性极性物质,即使用100%水相做流动相,且无论在色谱柱能承受的pH范围内怎么去调节pH,保留能力都不够。如果需要分离的组分中全是可以离子态存在的,那还可以选择离子交换色谱进行分离。不然的话,就只有选择离子对色谱方法了,尽管它有流传的那么多副作用存在。离子对试剂含亲水基和疏水基,很像表面活性剂,所以一开始离子对色谱也称为“皂色谱”。离子对作用的机理有两种解释,你上面都已经提到了。到底是哪种解释对,尚无定论,实际上也没必要去定论,反正两种解释都通就可以了。
我个人认为,两种机理都可能存在,要看离子对试剂、固定相和分析物这三者本身情况而定。如果离子对试剂的疏水端和固定相之间的结合力相对更强,示意图的作用机理会占上风。反之,离子对试剂亲水端和分析物导致掩藏极性端的作用力更强,你后面提到的机理更可能。总之,要看你用的什么离子对试剂,是何种的分析物等具体情况不同而不同吧。
48、我们在用的氨基柱时,有时候峰型突然变宽,有拖尾,用一段时间就又好了,不明白是什么原因造成的,如果要再生氨基柱的时候应该怎么做呢?是像您先前回答的问题中提到的,用一定比例的氨水冲洗吗?氨基柱可以直接用纯水冲洗吗?记得当时买的氨基柱那个使用说明书上说不能用纯水冲?是这样的吗?如果可以冲的话,一般冲多久?
答:氨基柱的硅胶孔内的氨基浓度非常高(大约有1mol/L),在有水存在的时候,在孔内形成一个pH10左右甚至超过10的很强的碱性小环境,并会导致硅胶基体慢慢溶解。不过硅胶基体的溶解会生成酸性的硅醇基,又会降低孔内的pH值,延缓硅胶基体的溶解进程。一段时间后,两个相反的过程会达成一个动态平衡,从而稳定下来。对你问题提到的这个现象,我想到的是这个原因。
氨基柱,要看氨基柱的应用模式,是正相还是HILIC?这两种模式的情况是大不相同的。正相使用,一般很怕有水。但HILIC模式应用,一般流动相是乙腈/水,是不怕水的。不过键合氨丙基基团非常容易水解,所以一般氨基柱不适宜保存有水的溶剂中。作为正相应用时,流动相中要求一点都不能含水,但清洗柱子上的污染物质,是可以含水的,因为水有强极性,在正相色谱上洗脱能力极强,当然不必用100%纯水。氨基柱具体冲洗方法,正相条件按照正相硅胶柱的清洗方法,HILIC模式按C18柱的清洗方法。
49、采用国标用C18柱测定辣椒精辣度,将辣椒精中添加吐温系列乳化剂做成水溶辣椒精,请问乳化剂对C18柱是否有影响?
答:乳化剂和离子对试剂类似,有极性端和非极性端,肯定会对C18柱有影响。不过如果辣椒精是极性物质,乳化剂的存在到可以提高其在C18柱上的保留能力。
50、公司按照国标测定辣椒红色素中苏丹红含量,标品分离很好,峰也不错,但是辣椒红色素由于跟苏丹红性质很相似,且颜色较深,分离效果很差,收得率很低,测定结果偏差很大。该如何处理样品?色素是否会降低柱效?
答:色素不会降低柱效,但辣椒红色素主峰浓度过大,会影响与临近杂质峰的分离。可考虑稀释样品,或试试用柱效更高的柱子。
51、通常我们在分析天然药物成分的时候结构复杂,无法考察组分的PKa值,哪我们如何去选择最合适的流动相或者是拖尾该怎么改善呢?
答:如果天然产物中没有易电离的极性基团,就不需要用缓冲盐调节pH。如果天然产物中既有酸性基团,也有碱性基团,譬如有pKa=6.2的羧基和pKa=9.0的氨基的两性物质,建议将pH用磷酸盐缓冲盐控制在2.4。如果pH控制在6.2-9.0之间,两个基团都处于离子态,保留能力最差,是最不可取的。如果不清楚复杂物质中含有什么基团,也请将pH调到2.4或更低。因为pH调低,起码抑制了酸性基团的电离而处于中性分子状态,而增加酸性基团这个部分在反相色谱中的保留能力;另外低pH还抑制了硅醇基的活性,有利于获取对称的峰形。情况不明时候,为什么不建议调高pH呢?一方面一般色谱柱都不能承受pH9以上的条件;调高pH和调低pH相比,还有一个硅醇基活性大的劣势。
52、记得以前拿到C18柱,会用甲醇从小流量到大流量慢慢活化,这样做的目的是什么呢?是先用溶剂活化吗?然后再用样品?还有测定短肽总是冲出来,该怎么解决呢?就是和溶剂峰出在一起,或者出在溶剂峰之前。
答:C18柱,会用甲醇从小流量到大流量慢慢活化,因为色谱柱到达用户手中时,时间长短不一,在存储和运输的过程中,可能存储液有些挥发,低流速的甲醇可以很好的浸润固定相,使键合相很好的伸展,用溶剂平衡好系统后,可以采取多次进样或者加大进样量的方式以更快的获得重现的色谱图,这样用样品将色谱柱中的活化点饱和,就不会出现异常色谱现象的情况。
53、C18柱如果之前曾有些天一直保存在酸性环境中,会对柱子有什么损坏吗?pH在2左右。
答:pH2左右容易使键合在硅胶基质上的固定相水解流失,包括C18和封尾试剂的水解,封尾试剂相对更容易水解。不知道你保存的酸性环境是不是含有缓冲盐,如果不含缓冲盐,只是短期几天保存在酸性流动相中,也不必过份担心,最多相当于这几天一直在使用这根色谱柱,因此减少几天的使用寿命吧;有缓冲盐就麻烦一点,保存期间水分挥发可能会导致缓冲盐结晶在柱内析出,对柱子损伤很大。
54、色谱柱的安装有什么技巧吗?只要保证不漏就行了吗?还有所谓的死体积怎么测定呢?
答:色谱柱安装技巧不多,只要接头和柱头匹配,确实拧紧不漏就可以了,但也要注意不要拧得太紧以至于损伤螺纹。所谓死体积就是完全不保留的物质出峰时从进样到流过色谱柱的总体积,一般用极性非常强的尿嘧啶的出峰来测定。死体积包括柱体积(色谱柱内溶剂能占据的空腔体积)和柱外体积两部分。你从厂商这里买到色谱柱,柱体积已经是固定了,你能尽量避免减少的是柱外体积。进样器内死体积、毛细管长度、毛细管和色谱柱连接紧凑与否,保护柱或在线滤器产生的死体积大小,都对这个有影响。样品在柱内,除扩散外,还有和填料作用引起的组分分离;但样品在柱外,那就只有扩散这个使柱效下降的因素了。
所以,要取得好的分离效率,柱外体积应该是越小越好。峰有时候前延,有时候拖尾,一般不是色谱柱的问题,应该是样品和色谱柱填料的作用问题,可以说如果色谱柱类型选择没问题,关键就是色谱条件的选择。包括进样量、样品溶剂、流动相组成(包括添加剂)、流动相pH以及柱温,都对峰形有影响。另外测定分子量较大的多肽,用样品老化平衡色谱柱很重要,分子量越大的物质,需要平衡时间越长。如果柱子没平衡好,峰形也可能会不正常。所以最好把你具体的测定条件也列一下,也便于有针对性的分析原因。
55、测定多肽样品时,十几肽或者二十几肽时,有时峰前延的比较厉害,有时峰拖尾比较厉害,这是什么原因呢?是样品的问题还是柱子的问题?
答:峰有时候前延,有时候拖尾,一般不是色谱柱的问题,应该是样品和色谱柱填料的作用问题,可以说如果色谱柱类型选择没问题,关键就是色谱条件的选择。包括进样量、样品溶剂、流动相组成(包括添加剂)、流动相pH以及柱温,都对峰形有影响。另外测定分子量较大的多肽,用样品老化平衡色谱柱很重要,分子量越大的物质,需要平衡时间越长。如果柱子没平衡好,峰形也可能会不正常。所以最好把你具体的测定条件也列一下,也便于有针对性的分析原因。
56、关于配置流动相,有机相我们可以甲醇乙腈同时用,这个是基于什么考虑的?是不是根据甲醇乙腈选择性不同、样品在这个两者的溶解度的差异以及调节洗流动相脱能力来考虑的?
答:甲醇和乙腈同时用,可以获得单纯的甲醇或者乙腈不一样的选择性,而且洗脱能力也会改变,根据多元流动相的强度因素Sab.....=Saψa+Sbψb=...Sa和Sb纯溶剂,a和b的溶剂强度因素;ψa、ψb分别为a和b的体积分数,所以在药典中有很多体系都使用甲醇乙腈体系。
57、三乙胺磷酸盐缓冲液作流动相,柱压一天比一天高,该怎么样解决?
答:把柱子再生下,再生的方法搜一下有很多,反冲对绝大部分色谱柱都是可行的,效果不错。
58、新出厂液相色谱柱,保护溶剂一般是什么?怎样进行平衡清洗比较好,一般要平衡多长时间比较好?
答:柱子类型不同,保存溶剂也会不一样吧,具体要看说明书的说明。对于反相柱,一般用甲醇(乙腈)保存,也有用80%左右甲醇浓度的甲醇/水保存的。一般用流动相平衡冲洗10-20个柱体积即可(注意:柱体积不等于空柱管体积,4.6x250mm的色谱柱空柱管体积是4.15ml,而柱体积只有约2.5ml)。
59、据说液相色谱柱柱压达到一定高度就不能使用了,请问一般达到多高,用甲醇和乙腈是不是不一样?
答:柱压不是色谱柱不能使用的唯一因素,分离度才是最重要的。柱压只要没高到仪器不能承受的地步,例如超过300bar,就可以一直使用。甲醇的粘度比乙腈高,同样状况的柱子,如果用甲醇做流动相,柱压可能超了,换用乙腈会使柱压下降不少,仪器还能承受。不过尽管柱压还没上升到接近400Bar的限定,如果发现柱压上升速度较快,也需要及早对柱子进行清洗维护,从根本上排除导致柱压上升的源头。
60、柱塞板可不可拆下用超声波清洗,会有什么不良后果?
答:不建议将柱筛板拆下清洗,因为拆下承压的柱筛板会导致柱床发生变化,影响色谱性能。应该对污染的色谱柱先进行清洗维护,维护没有效果,再把拆洗柱筛板作为最后的手段。