主题：【第八届原创】辣椒油中罗丹明B的检测（GPC净化）

辣椒油中罗丹明B的检测

凝胶色谱净化-液相色谱质谱法对辣椒油中罗丹明B的检测

摘要：采用凝胶色谱净化，液相串联质谱法，建立了对辣椒油中罗丹明B的检测，试验辣椒油中的罗丹明B用乙酸乙酯-环己烷（1:1体积比混合溶液）提取，凝胶色谱(GPC)净化，浓缩定容，液相色谱串联质谱法检测。本方法采用了5ug/kg，10ug/kg，25ug/kg，50ug/kg，4个添加浓度，每个浓度6个平行样品，罗丹明B的回收率在80%~100%，相对偏差在1.23%~2.69%。
关键词：凝胶色谱；液相串联质谱法；辣椒油；罗丹明B

Determination rhodamine B in capsicol by Gel permeation chromatography cleanup - Liquid chromatography tandem mass spectrometry

Abstract：A method was established for the determination of rhodamine B in capsicol by Gel permeation chromatography cleanup - Liquid chromatography tandem mass spectrometry. After extracted by ethyl acetate-cyclohexane (1:1 volume ratio) and cleansed by Gel permeation chromatography, the capsicol were detected by liquid chromatography tandem mass spectrometry. This method usesd 4 spiked concentrations for 5ug/kg,10ug/kg,25ug/kg,50ug/kg and each concentration used six parallel sample. Recoveries rhodamine B was 80%~100% and the relative deviation of 1.23%~2.69%.

Key words：Gel permeation chromatography；Liquid chromatography tandem mass spectrometry；capsicol；rhodamine B

1引言
  罗丹明B又称玫瑰红B，是一种具有鲜桃红色的人工合成的碱性荧光染料，主要用于造纸工业、打字纸、有光纸等；如将其作为染料用于食用产品中，易导致人体皮下组织增生肉瘤，具有致癌和致突变性，我国于2008年明确规定不允许将罗丹明B用于食品添加剂及染色剂。本文建立了凝胶色谱（GPC)净化，液相串联质谱法对辣椒油中罗丹明B的检测方法研究，本方法检测灵敏度高，回收率好，干扰少，通过对样品的检测分析，结果令人满意。
2实验部分
2.1仪器与试剂
2.1.1试剂
    乙腈：德国默克，色谱纯
    乙酸乙酯：德国默克，色谱纯
    环己烷：德国默克，色谱纯
    甲酸：色谱纯
2.1.2仪器
    涡旋混合器：IKA
    旋转蒸发仪：EYELA
    凝胶色谱净化仪（GPC)：Lab Tech（莱伯泰科）Auto Clean
    液相色谱质谱联用仪（LC-MS/MS）Thermo TSQ QUANTUM ACCESS，ESI源
2.2样品提取
    称取2.0g样品（精确至0.01g）于50ml离心管中，加入25ml乙酸乙酯-环己烷（体积比1:1混合溶液），涡旋混合器上混匀，超声提取15min，离心，取上清液于40℃旋转蒸发至干，加5ml乙酸乙酯-环己烷（体积比1:1混合溶液）溶解，待净化。
2.3样品净化
    取待净化液于GPC净化管中，用GPC进行净化，流动相为乙酸乙酯-环己烷（体积比1:1混合溶液），流速5ml/min，检测波长254nm，满环进样（2ml），收集时间9-19min，收集洗脱液于40℃旋转蒸发至干，用1ml甲醇溶解，过0.22um滤膜，上机检测。
2.4色谱质谱条件
  液相条件：C18色谱柱，流速0.3ml/min，流动相1‰甲酸水和乙腈梯度洗脱。
  质谱条件：电喷雾离子源，正离子扫描，多反应监测，喷雾电压、鞘气、辅助气、毛细管传输温度、碰撞能量调节使质谱灵敏度达到最佳。
3.结果
3.1 色谱质谱条件的优化
  流动相优化如下：
色谱柱：C18，100mm*2.1mm*5um或相当，柱温30℃
流动相：1‰甲酸水：乙腈，流速0.3ml/min，

时间/min	1‰甲酸水	乙腈
0.01	80	20
2	80	20
5	20	80
6	20	80
7	80	20
10	80	20

3.2质谱条件
A. 离子源:电喷雾离子源ESI
B.扫描模式：正离子扫描
C检测方式：多反应检测（MRM）
D.喷雾电压：4500V
C.鞘气30，辅助气10，毛细管传输温度350℃
D.定量定性离子和碰撞能量条件如下：

被测物	定性离子	定量离子	采集时间（ms）	碰撞能量（ev）
罗丹明B	443/355	443/399	100	60
	443/399		100	43

3.3罗丹明标准品谱图如下

3.4线性方程

  配置混合标准系列工作液，浓度为0，5.0，10，20，30，50，100ug/L。分别以选定的定量离子峰面积与浓度绘制标准曲线，罗丹明B在0~100ug/L的范围内呈良好线性，r²均大于0.99。

3.5 回收率试验

  取同一批阴性样品，加入适量的混合标准液，使加标量在5ug/kg、10ug/kg、25ug/kg和50ug/kg四个浓度，每个浓度做6个平行，求其平均回收率，并计算批内相对标准偏差。

化合物	加标量（ug/kg）	平行1	平行2	平行3	平行4	平行5	平行6	平均回收	RSD值
罗丹明B	5	87.30%	83.20%	88.20%	84.60%	85.80%	85.40%	85.75%	2.11%
	10	90.74%	90.74%	91.74%	92.54%	89.94%	94.74%	91.74%	1.88%
	25	92.47%	90.47%	89.07%	93.07%	87.07%	93.07%	90.87%	2.69%
	50	97.27%	95.47%	97.57%	94.47%	95.47%	96.17%	96.07%	1.23%

4 讨论
4.1GPC净化条件的选择
    实验中分别取1mg/kg的标准品1ml加到GPC管中，用5ml乙酸乙酯、5ml环己烷、5ml乙酸乙酯-环己烷（体积比1:1混合溶液）分别溶解，用GPC进行净化，结果发现5ml乙酸乙酯-环己烷（体积比1:1混合溶液）的净化效果最好，我们发现GPC净化时，用流动相溶解净化液，检测时净化效果最好；因此我们选乙酸乙酯-环己烷（1:1体积比混合溶液）溶解净化液。
4.2 GPC接收时间的选择
    实验中取1mg/L的标准品1ml加到GPC净化管中，用5ml乙酸乙酯-环己烷（1:1体积比混合溶液）溶解，上GPC检测，发现9-19min峰能完全出完，因此确定接收时间为9-19min。
4.3质谱条件的优化
    取1mg/L的标准品用蠕动泵的方式直接进入质谱，由于化合物本身的特性，该化合物在正离子源模式的响应及稳定性要高于负离子源模式，因此我们选用正离子源模式；调试离子源的喷雾电压，查看化合物Q1离子图的响应，发现化合物在喷雾电压4500V的条件下，Q1的响应最高，因此设定喷雾电压4500V，根据化合物的响应选取合适的气流量；在Q3的模式下选取响应较高较稳定的2个子离子，在MRM模式下，选取各子离子响应最高最稳定的碰撞能量，因此根据选好的各参数设定了该方法的质谱条件。
4.4液相条件的优化
    实验过程中选用了甲醇和1‰甲酸水、甲醇和水、乙腈和水、乙腈和1‰甲酸水为流动相，分别进行了等度和梯度洗脱，结果发现乙腈和1‰甲酸水梯度洗脱该化合物峰形和响应最好，最稳定，因此选用乙腈和1‰甲酸水为流动相，进行梯度洗脱。
4.5数据分析
    实验过程中从不同的超市和市场抽取了多份辣椒油样品进行检测，结果发现未有阳性的样品，说明该地区的产品是可以放心使用的。
4.6小结
该试验证明本方法简便、快速、准确,方法的定量下限为5ug/kg，凝胶色谱净化，液相色谱串联质谱法测定辣椒油中罗丹明B的检测方法可用于辣椒油中罗丹明B残留的确证检测。