主题:液相色谱法检测苯甲酸、山梨酸、糖精钠的疑难详解

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shime
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苯甲酸、山梨酸、糖精钠是衡量食品卫生质量的重要指标,苯甲酸、山梨酸的检测参照GB/T5009.29-1996,糖精钠的检测参照GB/T 5009.28-1996,即可开展实验。

苯甲酸、山梨酸、糖精钠虽是较常见的检测项目,但是要得到一个准确可靠的结果,也存在一定的难度,许多新手常出现因对方法理解发生偏差而检测出错的事故。笔者根据自己多年该方面工作的实际经验出发,以苯甲酸、山梨酸为着重点,从样品前处理、检测仪器的选择、超标时的判断等几个易出问题的方面,进行了详细的阐述。

2  样品前处理的注意事项

    GB/T5009.28-1996和GB/T5009.29-1996  在文字结构上有缺陷,在涉及用仪器法测定苯甲酸、山梨酸、糖精钠时,只讲述了液体样品的前处理方法,没有涉及对固体样品的前处理。

食品样品往往含有大量的油脂、蛋白质,对提取极为不利;如处理不干净也会污染色谱柱,影响检测工作。这类样品处理的关键在于如何找到一种较理想的沉淀剂,尽量排除待测样品中的油脂、蛋白质,且不影响待测物组分的回收率。

GB/T5009.29-1996使用5%硫酸铜溶液沉淀蛋白,对于蛋白质含量较低的食品尚可,对于豆粉、奶粉、月饼等高油脂、高蛋白样品则沉淀效果不理想。如用10%钨酸钠溶液作为沉淀剂,效果好些;如用10%亚铁氰化钾溶液和20%醋酸锌溶液则效果更理想(这是笔者目前用过最理想的沉淀剂)。

具体操作步骤如下:

取一定量样品,捣碎,利用四分法原理称取样品5.0 克于50ml比色管中,加水20ml,浸泡、振荡均匀,加入氢氧化钠溶液(1mol/L)1.0 ml,加入9.5mL10%亚铁氰化钾溶液, 9.50mL 20%乙酸锌溶液,定容,振荡使其充分混匀后,用滤纸初滤除去沉淀物, 初滤液过0.45μm微孔滤膜,收集滤液于样品瓶中,样品处理液和标准有溶液各进样5uL测定。

用这种方法简单易行,接触有机试剂少,重复性和回收率都令人满意;缺点是一定要用液相色谱法检测,有一定局限。

3  检测仪器的选择

虽然液相色谱仪操作起来比气相色谱仪要复杂,但笔者建议如条件许可仍尽量用液相色谱法检测。原因如下:

3.1  液相色谱法所用的样品处理方法远比气相色谱法简单,且不需使用有机试剂。尤其对于高油脂样品(如月饼)若采用碱化-排油-酸化-提取-挥干-溶解等步骤,再上气相色谱仪检测,工作量大,试剂毒性也大,且结果由于处理步骤太多而难以保证准确。

3.2    用液相色谱法还可同时完成糖精钠项目的检测,而气相色谱法只能做苯甲酸、山梨酸的检测。

3.3    液相色谱仪所用的紫外检测器比气相色谱仪的氢火焰检测器灵敏,可进行更低含量的检测。如用二极管阵列检测器,还可辅助定性,这更是气相色谱氢火焰检测器不可比拟的。


4  选用气相色谱仪时的注意事项

      GB/T5009.29-1996所用的气相色谱柱为 5%DEGS+1%磷酸固定液的60-80目 Chromosorb W AW,。这种柱有性能稳定、重复性好、保留时间稳定的优点,但同时也有稳定时间较长的缺点。

该柱的适用的样品提取溶剂为石油醚或乙醚,如果用甲醇或乙醇,则溶剂峰拖尾效应较大,对山梨酸的测定有影响。

如用毛细管柱,能取得更好的峰形和灵敏度,但其稳定性及特异性不如填充柱。一般可用非极性毛细管柱,0.530mm内径,10-15m长度。色谱条件可能需用程序升温。

气相色谱仪上的出峰次序为先出山梨酸,后出苯甲酸。

糖精钠不能直接用气相色谱进行检测,必须衍生化后才能汽化进样。

5  选用液相色谱仪的注意事项

    按照GB/T5009.29-1996,流动相应为5:95的甲醇:0.02M醋酸铵溶液,但是这个比例仅是个参考值,我们在工作中应根据实际情况进行调节。

    为什么用甲醇溶液?甲醇有两个作用,(1)防腐,液相色谱柱最怕流动相长菌,尤其霉菌。甲醇可使蛋白质变性,有杀菌作用。(2)调节流动相极性,这是最重要的一点。甲醇在溶液中比例的较小变化都会使苯甲酸、山梨酸、糖精钠的保留时间发生明显的改变,因此可以通过改变流动相中甲醇含量,以调节这几个组分的出峰和分离,以得到较理想的色谱图。

5:95是一个通用的比例,如减少甲醇含量,苯甲酸、山梨酸、糖精钠的出峰时间变慢,扩散效应增大,峰形较差,但这三组分的分离情况较好。如增加甲醇含量,苯甲酸、山梨酸、糖精钠的出峰时间提前,扩散效应较小,峰形尖锐,但这三组分的分离情况可能受影响,产生重叠。在选择条件时,只能通过实验手段,如配制3:97,4:96,5:95,6:96,7:93的流动相,综合考虑分离效果和分离时间选择最佳比例。

不同柱的最适比例不同,举例来说,色谱科公司的液相柱最适比例为4:96,而岛津公司液相柱的最佳比例为7:93。就是同一根柱,一年前和一年后的极性也会有变化,需调节溶液配比。

为什么使用0.02M醋酸铵溶液?加入醋酸铵是为了调节离子强度,使待测物的峰形不致于变坏。如果单独检测苯甲酸和糖精钠,加不加醋酸铵没有什么关系,都可以得到较好的峰形;但是检测山梨酸时流动相一定要加醋酸铵,否则得不到一个完整的色谱峰,峰形呈破裂状。

醋酸铵溶液浓度不需严格控制,0.01M、0.02M、0.04M均可。

苯甲酸、山梨酸、糖精钠在液相上的出峰次序很有特点。在流动相5:95及以下比例时,次序是苯甲酸、山梨酸、糖精钠(注意一下气相的出峰次序),逐步增大甲醇含量,苯甲酸、山梨酸的出峰时间逐步提前,而糖精钠是出峰时间迅速提前,随着甲醇比例的逐步增大(15%-30%),原先在最后出峰的糖精钠集次和前面的山梨酸、山梨酸重叠,并位于最前面,其次序变为糖精钠、苯甲酸、山梨酸。再提高甲醇浓度,次序不变。

用高甲醇比例条件(甲醇15%以上)做出的三种标准物质色谱图峰形较好,出峰时间也较快,但做实际样品时干扰较大;因此建议尽量使用低甲醇比例条件(甲醇5%左右)。

6  苯甲酸、山梨酸超标时的判断

苯甲酸、山梨酸超标的样品较多,由于它们往往牵涉到一批货物是否合格,因此责任重大。由于该方法定量较准确,因此遇到超标样品时应将精力集中于定性方面。

如同时有气相色谱仪液相色谱仪,建议用这两种性质相差较大的仪器进行对照,如定量结果差不多,即可确认。

如只有气相色谱仪,应利用其在填充柱保留时间稳定的特性,同时进五针标准液和五针样品液(注:峰面积应差不多,否则需对一方按比例稀释),如标准和样品液的保留时间相差时间超过1 秒,可认为不是。(如进针的技术不过关,请不要做此实验)

如用液相色谱仪,当检测器为二极管阵列检测器时,根据保留时间和紫外吸收图结合定性,当只有紫外检测器时,改检测波长为220nm,230nm,250nm,重复进标准和样品液,由标准和样品在不同波长的峰高比值看是否吻合。

如有微生物检测手段,可加样品于有菌培养基中,观察有无抑菌现象,如无抑菌现象则无防腐剂。

不是很推荐用双柱法,因为有时柱极性相差不大,反而会影响最终判断。

7  糖精钠超标时的判断

当检测糖精钠超标时,除了采用二极管阵列检测器或波长验证,还可以利用糖精钠的荧光特性,用荧光检测器进行验证。荧光条件是激发波长为277nm,荧光波长为410nm。只有当用荧光检测器和用紫外检测器做出的定量结果相差不多,才可以判断为是。

还有一个简单粗糙、却也行之有效的验证方法,即感官法。糖精钠是一种甜味剂,用舌头可以感觉到它的甜味,如果含量超标,一定能尝出来。

8  标准溶液的配制贮存问题

苯甲酸、山梨酸、糖精钠的标准溶液如用水、乙醇作基体,一般几个月后会严重降解,。如用甲醇溶解再放于冰箱冷冻层,可保持稳定一两年。因此推荐用甲醇作溶剂。

在配制标准溶液时,初学者常犯的错误多为用甲醇溶解苯甲酸钠,用水溶解苯甲酸,晃了半天才发现怎么也不没溶解。应该用弱碱性水溶解苯甲酸钠、山梨酸钾,用甲醇溶解苯甲酸、山梨酸。

9  苯甲酸、山梨酸的应用范围

首先应注意到,并不是所有食品都需要加入防腐剂,只有那些富含营养物质,且需要长时间暴露于空气的才有这样的需要,否则对厂家来说会增加不必要的成本。

酱油、酱料、咸菜、浓缩果汁等由于开封后不可能短期内吃完,月饼等需在货架上摆放,如不加防腐剂很快会发霉变质,有添加防腐剂的必要。而利乐装或易拉罐装的饮料由于很快可以食用完毕,即在细菌大量繁殖前己被消化了,因而没有添加的必要。

苯甲酸、山梨酸如果要起到防腐的作用,含量就不能太低。如果我们检测样品时只有几个ppm的浓度,有可能是从原料中带来的或由其它添加剂转化来的,而不是厂家出于防腐目的加入的。

苯甲酸、山梨酸也只是防腐剂中的两种。并不是所有需要加入防腐剂的食品都会添加苯甲酸、山梨酸,有可能使用防霉剂或其它种类的防腐剂,或自行规定需冷藏(如某些月饼)。因此有些食品检测不出也属正常。

另外,我们应该比较清楚地理解苯甲酸与苯甲酸钠、山梨酸与山梨酸钾之间的关系。在食品中添加防腐剂通常以苯甲酸钠、山梨酸钾形式加入,它们不易汽化,易溶于水,但不溶于甲醇等有机试剂;而苯甲酸、山梨酸易汽化,易溶于有机试剂,但
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上周客户正好买了台液相,组建实验室做苯甲酸、山梨酸、糖精钠检测,看了疑难详解,蛮不错,正好发给他们,谢谢了!
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刚看了你的帖.现有一问题请教:-5009.29上是用碳酸氢钠溶液溶解,水定容.刚看了你写的,用甲醇溶解.是不是称了标准物质后直接用甲醇溶解定容到刻度即可?
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多谢shime精辟论述. 有一点请教: "糖精钠不能直接用气相色谱进行检测,必须衍生化后才能汽化进样", 如何衍生化? 有国标方法吗?
snowingtree
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现在都用GB/T5009.29—2003了,差不多的吗?
高手必定是高手?
GB/T5009.28-1996和GB/T5009.29-1996 在文字结构上有缺陷,在涉及用仪器法测定苯甲酸、山梨酸、糖精钠时,只讲述了液体样品的前处理方法,没有涉及对固体样品的前处理。GB/T5009.29—1996的范围是饮料类所以没有固体的处理方法,平时都是参照在做
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