主题：【分享】【金秋计划】基于特定靶点的中药活性成分筛选策略

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发表于：2024/09/10 12:56:12 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

白芍（Radix paeoniae alba，RPA）具有抗炎作用，已被报道可以抑制细胞增殖和促炎细胞因子（TNF-α、IL-1等）的产生。然而，目前对RPΑ的抗炎机制以及其药理作用的潜在活性成分和直接结合的靶蛋白知之甚少。由于TNF-α通过肿瘤坏死因子受体1（TNF-R1）信号通路在炎症反应中发挥作用，对RPΑ中与TNF-R1结合的活性成分进行确认有助于理解RPΑ抗炎作用。基于表面等离子体共振（SPR）的中药主要活性成分筛选策略，以中药白芍为例，确定了其中能够特异性结合TNF-R1进而发挥抗炎作用的化合物。表面等离子体共振（SPR）是药物发现中的经典工具，可以同时提供分子相互作用的动力学和平衡特性，而UPLC-QTOF/MS是对中药成分进行定性和定量分析的有力工具，SPR与UPLC-QTOF/MS系统相结合可以筛选与特定蛋白直接结合的活性成分。

1、建立TNF-R1结合的小分子筛选系统

研究首先将TNF-R1蛋白固定在CM5传感器芯片上，同时分别以TNF-a和Tetracycline（四环素）为阳参和阴参，注入SPR系统中发现，TNF-a能够与TNF-R1蛋白结合而Tetracycline不能（图1A）。同样的，将TNF-a固定在CM5芯片上，将TNF-R1和Tetracycline注入SPR系统中同样发现，TNF-R1能够与TNF-a结合而Tetracycline不能（图1B）。表明该系统可以特异性检测与TNF-R1结合的小分子。

2、筛选白芍中与TNF-R1结合的小分子

将干燥的白芍（RPA）根部磨成粉后取1g采用10ml 80%的甲醇提取，收集上清液4 ℃备用。将一系列不同稀释比例（0、1:1000、1:500和1:250）的RPA提取物注入TNF-R1芯片60秒，然后解离120秒，回收和鉴定TNF-R1结合的化合物，回收溶液用氮气浓缩并在 UPLC-QTOF/MS系统上鉴定，芍药苷和丹皮酚被认为是潜在的活性成分（图2A-2D）。随后使用芍药苷和丹皮酚标准品确认了保留时间（图2E、2F），结果表明芍药苷和丹皮酚是RPA的TNF-R1结合成分。

3、验证白芍中与TNF-R1结合的小分子

为了进一步证实芍药苷和丹皮酚直接与TNF-R1直接结合，研究通过SPR测定确定了它们的亲和力常数，发现芍药苷的亲和常数为4.9 μM（图3A、3B），丹皮酚的亲和常数为11.8 μM（图3C、3D），结果证实RPA中的芍药苷和丹皮酚可以直接与TNF-R1结合。

4、白芍中与TNF-R1结合的小分子的功能验证作者最后采用细胞活力和凋亡分析通常用于评估两种小分子的的抗炎作用。结果显示TNF-α和Act-D对L929细胞产生近70%的细胞毒性，而芍药苷和丹皮酚以剂量依赖性方式抑制细胞毒性此外，研究发现经TNF-a和Act-D处理后，细胞凋亡水平显著升高至60.02%，20 mM芍药苷的诱导率为22.31%，丹皮酚治疗组也有类似的抑制作用（图7）。细胞活力和凋亡结果表明，这两种生物活性候选物干扰了TNF-a的生物活性，可能在RPA的抗炎活性中发挥重要作用。

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