主题：【分享】高效液相色谱技能篇|关于方法验证中常见几个概念的小知识

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发表于：2024/09/10 12:38:34 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

高效液相色谱（HPLC）中的分析方法验证是一个系统的过程，用于证明所建立的方法适合于其预定的检测要求。通常是在建立药品质量标准、变更药品生产工艺或制剂组分、修订原分析方法时进行。验证的目的主要是用来确保分析方法的可靠性、重现性和有效性，以确保获得的数据是准确和可靠的。验证的分析项目通常包括鉴别试验、杂质测定（限度或定量分析）、含量测定（包括特性参数和含量/效价测定）。验证的指标包括专属性、准确度、精密度（包括重复性、中间精密度和重现性）、检测限、定量限、线性、范围和耐用性。我们今天主要是对验证指标中的几个基础的概念进行阐述，以便大家更好的理解中国药典中9101的指导原则（最近药典委对9101的指导原则也启动第二次公示了，后面再陆续讲解其中内容）

01.专属性

专属性是指在样品中其他成分存在的情况下，采用的分析方法能够准确且专属地测量目标分析物的能力。在对方法专属性的评估中，我们经常要考虑来自于其他活性成分、辅料、杂质、降解产物等对目标分析物的干扰程度。一般破坏性的样品可以通过酸、碱、光照、高温等条件处理，以模拟可能的降解情况，并检查色谱图谱以确认目标成分的峰是否清晰可辨。

通常情况下，在验证方案中，我们会给定分析物的分离度、色谱柱的塔板数(柱效)和拖尾因子用于测量和证明分析方法的专属性。

对于专属性是否可通过，我们通常会采用这几种方式来描述：

1）缓冲体系对样品是否产生干扰：即你上一个样品的缓冲体系，在含量测定或杂质检测中，缓冲体系在主峰附近应无明显的杂质峰或干扰峰；如果有，应明确所在的位置及影响情况。

2）与其他成分分离情况：在含量测定和杂质检测中，可以通过评估样品中两个洗脱顺序最接近的成分的分离度来证明专属性。这通常涉及到主要成分或活性成分及其最接近的杂质。如果这些杂质或辅料可以获得，验证过程中需要确保它们的存在不会影响含量测定的结果。如果无法获得这些杂质，可以通过将测试结果与另一种已经验证的方法或药典方法的结果进行比较来进行验证。

就好比你样品中的多聚体或者降解产物，与主物质的分离度；如果满足大于1.5的情况，则对含量的计算是否无影响；如果满足不了大于1.5的情况，再要求其峰谷比是否满足1.5；如果还不满足，则可能需要调整方法。

3）与已知参考物的比较：利用二极管阵列检测器（DAD）或质谱（MS）技术进行峰纯度实验，可以有效地验证色谱分析中的专属性。DAD检测器可以在全波长范围内收集色谱峰的光谱数据，并通过软件处理，比较不同色谱峰的光谱，从而评估峰的纯度。这种方法可以揭示在常规色谱图中难以观察到的微小差异。

但DAD检测器在某些情况下可能存在局限性，例如在没有紫外吸收或系统噪声较高的情况下，可能会影响对色谱峰纯度的评估。此外，当两个物质的光谱非常相似，或者它们的吸收峰浓度比很大时，使用DAD检测器区分它们可能会比较困难。

质谱（MS）检测器则能够克服DAD检测器的这些局限性。MS检测器能够提供关于峰纯度的明确信息，包括准确的分子量、结构和含量信息。在HPLC系统中，DAD和MS的联用可以互补信息，确保在确证过程中不会忽视任何潜在的干扰因素。

02.准确度

准确度是一个分析方法正确性的量度，或者可视为样品的参考值与测量值之间的接近程度。在已建证的方法所覆盖的范围内，准确度是通过含量测定中分析物的回收百分率来测量的。

图1.准确度示例图

参考相关的指导要求，准确度一般是要求设计至少3种不同浓度，每种浓度分别制备至少3份供试品进行测定，用至少9份测定结果进行评价，且浓度的设定应考虑样品的浓度范围。（如下图）

图2.准确度示例表 1）什么是回收率？它是一种常用的准确度评估方法，特别是在药物分析中。在回收率实验中，已知量的纯标准物质（对照品）被添加到样品中，然后使用建立的方法进行分析。通过比较添加前后的分析结果，可以计算回收率，即实际回收的对照品量与理论添加量的比率。理想情况下，回收率应该接近100%，表明方法的准确度高。2）设计至少3种不同浓度是否有原则？这些浓度应该覆盖样品的预期浓度范围（一般是线性范围内），包括低、中、高三个浓度点。例如，可以设计为低浓度（相当于80%的目标浓度）、中等浓度（相当于100%的目标浓度）和高浓度（相当于120%的目标浓度）。3）每种浓度分别制备至少3份供试品进行测定，如何理解？对于每个浓度水平，至少制备三份独立的供试品溶液。如上述图2中的数据，分别进行3次实验，每次实验分别配制1mg、2mg、3mg的样品。即：第一次实验：A1、A2、A3；第二次实验：A1、A2、A3；第三次实验：A1、A2、A3；然后评价这9次实验的数据结果。（后续讲解......）