主题：【分享】【金秋计划】冬凌草乙素靶向Keap1介导PGAM5泛素化促进肝癌细胞线粒体凋亡

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发表于：2024/09/10 13:45:05 楼主管理分享倒序浏览只看楼主回复私聊

冬凌草乙素（Ponicidin）是从中药冬凌草（Rabdosia rubescens）中提取的二萜类化合物，具有免疫调节、抗炎、抗病毒和抗癌等多种活性。尽管冬凌草乙素对多种恶性肿瘤有疗效，但其与肝细胞癌（HCC）相关的确切功能和作用机制仍然未知。

冬凌草乙素体外显著抑制肝癌细胞增殖和迁移，体内抑制肿瘤生长并促进肿瘤细胞凋亡。机制上，冬凌草乙素靶向Keap1（E3泛素连接酶）并促进Keap1-PGAM5复合物形成，介导PGAM5的泛素化降解。此外，冬凌草乙素通过PGAM5激活半胱氨酸依赖性线粒体通路，导致线粒体损伤和ROS产生，从而促进肝癌细胞线粒体凋亡。

1、冬凌草乙素抑制HCC细胞的增殖和迁移

作者首先通过体外实验发现能以剂量依赖性方式有效抑制HepG2细胞的增殖和迁移。为了确定冬凌草乙素的靶标，作者合成生物素标记的冬凌草乙素（Bio-Ponicidin）开展Pulldown实验，通过质谱鉴定Keap1蛋白（Kelch-like ECH-associated protein 1，Keap1，E3泛素连接酶的底物识别亚单位）为冬凌草乙素的可能靶标。

2、PGAM5在HCC组织样本中上调

接着，作者利用TCGA数据库发现Keap1高表达与HCC患者较低的生存率有关，并利用HCC组织芯片发现肝癌组织中Keap1的表达高于癌旁组织，结果表明Keap1在HCC发病机制中具有潜在作用。

Keap1蛋白是一种重要的调节蛋白，可以通过与其他蛋白质相互作用来调节细胞内信号通路，于是作者通过文献检索发现PGAM5是一种与Keap1互作的重要蛋白质，且前面的Pulldown实验也显示PGAM5被拉下。

TCGA数据库分析显示PGAM5高表达与HCC存活率较低相关，组织芯片显示HCC组织中的PGAM5表达高于癌旁组织，且与较高的病理分级相关，结果表明PGAM5同样在HCC发病机制中具有潜在作用。

进一步作者通过人类蛋白质组微阵列检测冬凌草乙素的直接靶蛋白，发现冬凌草乙素与Keap1直接结合而不与PGAM5蛋白结合，结果表明冬凌草乙素可能直接与Keap1结合并影响PGAM5，从而在HCC中发挥药理作用。

3、Keap1和PGAM5相互作用的结构基础

Keap1可以与PGAM5结合，然而，它们结合的结构基础尚不清楚。为了观察Keap1与PGAM5结合过程的动态变化，作者通过分子动力学模拟发现Keap1-PGAM5复合物的结构总体上保持稳定，且PGAM5上的Val78、Glu79、Ser80和Glu83氨基酸与Keap1的Kelch结构域相互作用。采用AlphaFold3算法来预测 Keap1-PGAM5 的相互作用，发现复合物的总体预测折叠与真实结构相似。

4、Keap1-PGAM5配合物中晶体整体结构及相互作用的洞察分析

为了更好地理解Keap1和PGAM5相互作用的分子机制，作者进行了结构生物学实验。通过晶体学实验获得了Keap1-PGAM5配合物的结构，分析得到两者的结合模式和结合位点，并通过蛋白点突变后的ITC实验发现Glu79是Kelch与PGAM5结合的关键残基。

进一步作者通过SPR、CETSA、Co-IP、EMSA等实验验证冬凌草乙素和Keap1的Kelch结构域结合，而不能和Keap1的?54-PGAM5（54-289号氨基酸）突变蛋白结合。

考虑到Keap1是一种E3连接酶，促进蛋白质的泛素化和降解。作者发现冬凌草乙素可以增加PGAM5的泛素化，增加Keap1-PGAM5蛋白共定位，表明冬凌草乙素可以与Keap1结合，从而促进Keap1与PGAM5的互作，促进PGAM5的泛素化。

5、冬凌草乙素影响Keap1的Kelch结构域的变构来稳定Keap1与PGAM5结合

进一步通过分子对接模拟发现冬凌草乙素可以与Keap1的Kelch结构域稳定结合，而不是PGAM5。此外，Keap1-PGAM5复合物与Ponicidin结合后更稳定。冬凌草乙素的结合影响了Kelch结构域的变构模式变化，抑制了PGAM5的不稳定运动。总之，冬凌草乙素可以影响Kelch结构域的变构并促进Keap1和PGAM5的结合稳定性。

6、冬凌草乙素促进Keap1与PGAM5互作口袋的收紧稳定Keap1-PGAM5复合物

冬凌草乙素促进Keap1-PGAM5复合物的形成，作者进一步研究Keap1-PGAM5结合冬凌草乙素后相互作用口袋的变化，发现Keap1-PGAM5复合物在冬凌草乙素结合后具有更强的能量，且改变了Keap1-PGAM5复合物的构象分布。结果表明冬凌草乙素的结合加强了Keap与PGAM5之间的结合。

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7、冬凌草乙素通过PGAM5相关通路促进线粒体凋亡

有研究报道PGAM5可以通过与Bcl-xL相互作用参与细胞凋亡，作者推测冬凌草乙素可能通过PGAM5的泛素化在细胞凋亡中发挥作用。结果显示冬凌草乙素可以通过调节Bcl-2家族中的凋亡蛋白来触发HepG2细胞凋亡。作者进一步研究冬凌草乙素对线粒体的影响，发现冬凌草乙素治疗激活了半胱天冬酶依赖性线粒体通路，导致HepG2细胞中的线粒体损伤和ROS产生。

8、冬凌草乙素在体内可促进HCC细胞凋亡抑制肿瘤生长

最后，作者对BALB/c裸鼠进行了异种移植实验，发现冬凌草乙素治疗后肿瘤体积显著减少，肿瘤组织中凋亡相关蛋白上调，增殖相关蛋白下调。此外，PGAM5在HCC组织中高度表达，而冬凌草乙素降低其蛋白质水平。这些发现表明冬凌草乙素可以降低PGAM5水平，诱导凋亡，并抑制HepG2细胞增殖。

总结

天然产物冬凌草乙素靶向Keap1并促进Keap1-PGAM5复合物的形成，导致PGAM5的泛素化和降解。此外，冬凌草乙素通过PGAM5激活半胱氨酸依赖性线粒体通路，导致线粒体损伤和ROS产生，从而促进 HepG2 细胞中的线粒体凋亡。这些结果基于涉及Keap1-PGAM5复合物的机制为冬凌草乙素的抗HCC特性提供了见解。